Визуализация эндоплазматической сети субдоменов в культивируемых клетках

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы исследовать, как трансфицированные флуоресцентные белки распределяются и перемещаются в эндоплазматическом ретикулуме, а также оценить влияние экспрессии на ультраструктурную архитектуру. Для этого культивируемые клетки временно трансфицируют меченными GFP резидентными белками ER, привязанными к хвосту. После трансфекции проводится конфокальная визуализация живых клеток для оценки восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания или потери frap и флуоресценции.

При фотообесцвечивании или флипе ультраструктурный анализ выполняется с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Полученные данные показывают, что экспрессия меченого GFP конструкта B five резко изменяет организацию и структуру эндоплазматического ретикулума, индуцируя образование агрегатов. Метод, который мы демонстрируем здесь, может дать представление об основных процессах клеточной биологии, таких как подвижность и транспорт белков и липидов.

Он также может быть использован для изучения ответов на фармакологическое лечение для оценки флуоресцентного белка, олигомодернизации или для изучения роли патогенных мутантных белков в формировании внутриклеточных агрегатов происхождения, которые могут иметь отношение к их патогенности, например, при атрофическом боковом склерозе. Плазмида, использованная в этом исследовании, состоит из улучшенной версии GFP, слитой на ее С-конце с хвостовой областью er, изоформы крысиного цитохрома B 5 через линкерную последовательность. Хвостовая область B5 содержит всю последовательность, которая остается мембраной, ассоциированной после расщепления трипсином.

Это включает в себя трансмембранный домен из 17 остатков, окруженный восходящими и нисходящими полярными последовательностями. Линкер состоит из эпитопа M, за которым следуют GLY четыре S3. Вся КДНК встраивается в три сайта хинди XO one вектора экспрессии PC DNA three у млекопитающих. При подготовке к трансфекции выращивание стоило семи клеток в дополненном DMEM при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 за день до трансфекции пластины трижды по 10 до пятой клетки на круглом 24-миллиметровом стеклянном покрытии проскальзывает в шестилуночную пластину на следующий день.

Для трансфектации клеток с помощью струйной системы PEI, как описано производителем здесь, используется струя, соотношение PEI к ДНК два к одному. Обычно это приводит к эффективности трансфекции от 70 до 80%. Поддерживайте температуру клеток при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 24 часов перед визуализацией. Затем с помощью щипцов перенесите покровный листок с трансфицированными клетками в камеру визуализации.

Верните чашку для культуры тканей в инкубатор, чтобы сохранить оставшиеся клетки. Для ультраструктурного анализа методом электронной микроскопии. Для визуализации живых клеток добавьте два миллилитра среды для визуализации в камеру для культивирования стальных клеток.

Xi Fluor входит в состав среды визуализации для предотвращения фотообесцвечивания образцов. Эксперименты O должны быть проведены в присутствии смида, ингибитора трансляции, чтобы избежать любого увеличения сигнала флуоресценции А и, следовательно, общей флуоресценции за счет белка. Биосинтез. Поместите камеру визуализации на столик конфокального микроскопа, оснащенного CO2-инкубатором с регулируемой температурой и соответствующими лазерами с соответствующими настройками фотоумножителя для выполнения восстановления флуоресценции.

После фотообесцвечивания или фрекинга сфокусируйте клетки, установите параметры сбора данных, чтобы избежать насыщения пикселей. Также убедитесь, что мощность лазера установлена как можно ниже, чтобы избежать фотообесцвечивания из-за получения изображения. После настройки параметров изображения перейдите к новому полю зрения с двумя или более ячейками.

Одна клетка в каждом поле сбора данных должна оставаться неотбеленной, чтобы ее можно было использовать для нормализации флуоресцентного сигнала обесцвеченной клетки или клеток. Для отбеливания. Нарисуйте область интереса или ROI, соответствующую организованному гладкому эндоплазматическому ретикулуму или OSER.

Настройте программу визуализации на отбеливание, используя достаточное количество итераций для эффективного и быстрого фотообесцвечивания При необходимости можно использовать комбинацию лазеров 488 нанометров и 405 нанометров. Дайте указание программному обеспечению захватывать один кадр каждые 10 секунд в течение 10 минут в течение всего эксперимента. Это включает в себя предпосевный, отбеливающий и восстановительный периоды.

Как только все будет готово, начните отбеливание и захват. Когда съемка будет завершена, перейдите к новому полю зрения и повторите этот процесс. Захватите четыре-пять полей зрения для каждой обложки.

Проведите пальцем рядом, чтобы измерить флуоресцентные потери при фотообесцвечивании или флипе. Дайте указание программе выполнить последовательность обесцвечивания и визуализацию после отбеливания в течение 10 секунд каждые 30 секунд в течение 10 минут, перейти в новое поле зрения. Нарисуйте ROI, соответствующую структуре OSER, и инициируйте обесцвечивание и захват, как и раньше, для анализа.

Импортируйте изображения frap и flip в программу Image J. Во-первых, оцените восстановление флуоресценции обесцвеченного ROI с течением времени для экспериментов с гидроразрывом пласта, а затем определите фоновую флуоресценцию, выбрав область за пределами клеток, и измерьте ее среднюю интенсивность с течением времени. Затем вычтите фоновый сигнал из интенсивностей флуоресценции ROI.

Нормализуйте данные до общей флуоресценции обесцвеченной клетки, которая должна быть постоянной с течением времени. Затем подогнайте показано здесь моноэкспоненциальное уравнение, где F post — флуоресцентный сигнал после фотообесцвечивания. F rec – максимальное значение восстановления флуоресценции, достигнутое после обесцвечивания, T – окончательное время регистрации, а tau – среднее время регистрации.

Для анализа экспериментов с флипом нарисуйте ROI за пределами обесцвеченного OSER, охватывающего всю клетку, и измерьте интенсивность ее флуоресценции с течением времени. Что касается экспериментов с гидроразрывом пласта, вычтите фон, используя область за пределами клеток. Нормализуйте данные в соответствии с уровнями флуоресценции ROI, построенной на неотбеленной клетке, чтобы скорректировать любое снижение флуоресценции, вызванное самой визуализацией.

Наконец, постройте график результатов с помощью призмы GraphPad или аналогичного программного обеспечения. Многие реагенты, используемые при подготовке образцов для электромикроскопии, токсичны. Поэтому следующие шаги следует выполнять в лабораторном халате и перчатках во время работы под вытяжным шкафом.

Сняв покровное стекло с чашки Петри для оптической микроскопии, зафиксируйте оставшиеся клетки, выращенные на дне чашки, в виде монослоя на 10 минут при комнатной температуре. Затем, используя тефлоновый скребок, отделите элементы и перенесите их в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, гранулируйте клетки центрифугированием при 9000 G в течение 10 минут после отжима. Снимите надосадочную жидкость, добавьте свежий фиксатор и оставьте на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Промойте гранулы, осторожно отасунув фиксатор с помощью прошлой пипетки и добавив буфер для катов. Чтобы не потревожить гранулу, позвольте буферу стекать по боковой стенке трубки по мере ее добавления. Отсадите раствор для промывки и закрепите, добавив клетки в раствор 1% тетраоксида осмия в буфер Кате в течение одного часа при комнатной температуре.

Затем промойте водой Milli Q и добавьте 1% ацетата писсуара в дистиллированную воду непосредственно в микроцентрифужную пробирку. Разблокируйте краситель на срок от 20 минут до часа, обезвоживайте образцы в возрастающем ряду этанола 70%80%90%100% и снова 100% в течение 10 минут каждый. Затем дважды промойте гранулы в окиси пропилена каждый раз по 15 минут.

Инфильтрируйте образцы, заменяя оксид пропилена смесью оксида пропилена и эпона в соотношении один к одному, инкубируйте не менее двух часов и до ночи. Затем, чтобы внедрить образцы, поместите фрагменты клеточных гранул в формы для встраивания, которые предварительно заполнены эпоновой эпоксидной смолой, отверждаемой при температуре 60 градусов Цельсия, не менее чем на 24 часа. На следующий день установите смоляной блок на ультра-микротом, оснащенный алмазным ножом под углом 45 градусов.

С помощью обрезного ножа вручную обрежьте блоки смолы, чтобы удалить части блока смолы, в которых отсутствует внедренный образец. Затем с помощью ультра-микротома получите срезы от 60 до 70 нанометров. Соберите срезы на медных сетках 300 меш, чтобы испачкать срезы.

Поместите в сетки по 30 микролитров капель насыщенного раствора мочеприемника, ацетата, и выдержите 20 минут. Затем трижды промыть в воде milli Q и снова инкубировать сетки на небольших каплях цитрата свинца в течение семи минут. После инкубации тщательно промойте сетки, погрузив их в воду milli Q, и дайте им высохнуть при комнатной температуре.

Наблюдайте за окрашенными сетками с помощью просвечивающего электронного микроскопа и получайте изображения с помощью ПЗС-камеры, установленной снизу, при окончательном увеличении в диапазоне от 6 000 до 39 000 раз, чтобы исследовать латеральную диффузию D-E-G-F-P ER в организованном гладком эндоплазматическом ретикулуме. С помощью FRAP были проанализированы семь клеток из трех покровных слипов, как описано в этом видео, как показано в этой покадровой последовательности, две структуры OSER были обесцвечены, и с течением времени было зарегистрировано восстановление флуоресценции. Четкое восстановление флуоресценции было обнаружено через одну минуту после обесцвечивания с дальнейшим увеличением сигнала через четыре минуты для определения времени восстановления и количественной оценки подвижной фракции D-E-G-F-P-E-R.

Отснятые изображения были проанализированы так, как описано в этом видео, которое можно увидеть здесь. Интенсивность флуоресценции обесцвеченного участка со временем увеличивалась, демонстрируя, что флуоресцентный белок обладает высокой подвижностью в агрегатах. Для изучения преемственности между различными субдоменами эндоплазматического ретикулума были проведены эксперименты по перевороту ретикулума, как показано в этой последовательности.

Непрерывное обесцвечивание OSER, обозначенное здесь желтой стрелкой, вызывает прогрессирующее снижение флуоресценции в остальной части OSER и в других структурах OSER в пределах той же клетки. Красная стрелка указывает на участок неотбеленной клетки, в котором флуоресцентный сигнал является постоянным с течением времени. Количественный анализ этих данных выявил прогрессирующее и быстрое опорожнение ретикулярной ER, демонстрируя, что агрегаты физически связаны с остальной частью ER. Для изучения тонкой архитектуры этих агрегатов с помощью просвечивающего электронного микроскопа наблюдались клетки, экспрессирующие высокие уровни D-E-G-F-P.

На этой микрофотографии показано изображение цитоплазмы клетки с малым увеличением, содержащей совокупность мембран. Агрегат состоит из стека cyi и волнистых синусоидальных мембран. Что видно здесь.

Митохондрии можно увидеть, сгруппированными вокруг структур OSER, в то время как рибосомы, обозначенные наконечниками стрел, украшают только мембраны самых внешних циев. Обратите внимание, что электронно-плотное пространство толщиной 11 нанометров между мембранами непрерывно с цитоплазмой. OS ER может быть образован пластинчатыми er, которые представляют собой стопки сплющенных er cyi, которые могут быть непрерывными или фрагментированными по своему внешнему виду в тонких срезах, иногда можно наблюдать везикулы, отпочковывающиеся от самой внешней цистерны стопки, как показано здесь.

Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что флуоресцентные агрегаты, наблюдаемые в культивируемых клетках, трансфицированных D-E-G-F-P ER, представляют собой участки гладких и уплощенных er steri, которые пространственно организуются в четко определенные трехмерные геометрии. При проведении этой процедуры важно помнить, что все изображения должны быть получены без насыщенных пикселей, которые могут изменить восстановление флуоресценции и, следовательно, анализ подвижности белков. Всегда следует следить за тем, чтобы нормализовать флуоресцентный сигнал в отбеливателе, представляющей интерес для общей флуоресценции той же клетки, чтобы учесть изменения интенсивности флуоресценции из-за обесцвечивания во время получения изображения или небольших изменений в плоскости фокусировки.