Nucleofection из грызунов нейробласты по изучению нейробласта миграции

Общая цель данной процедуры заключается в трансфекции первичных постнатальных нейробластов грызунов для изучения влияния целевых белков на их миграцию. Это достигается путем первоначального выделения нейробластов из рострального миграционного тока потомства грызунов. Вторым этапом является их диссоциация и трансфекция методом нуклеофекции с использованием либо ДНК, либо shRNA.

Затем нейробласты повторно агрегируют в висячих каплях, после чего культивируют в суспензии в течение необходимого времени. Заключительным этапом является помещение повторно агрегированных кластеров нейробластов в трехмерный матрикс для последующей миграции. В конечном итоге для анализа миграции нейробластов используют иммунофлуоресцентный метод или микроскопию с функцией таймлапс-съемки.

Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области нейрогенеза, такие как механизмы контроля миграции нейробластов, производных стволовых клеток, в постнатальном мозге. Основным преимуществом этого метода является его относительная простота и быстрота по сравнению с использованием вирусных векторов, применение которых может быть затруднительным и трудоемким. После жертвования помета крыс P6–P7 с помощью скальпеля сделайте на каждой крысе задний разрез кожи вдоль срединного сагиттального шва от носа до мозжечка.

Затем снимите кожу. Повторите тот же разрез вдоль черепа. После этого осторожно удалите лоскуты кожи с помощью пинцета и аккуратно извлеките головной мозг вместе с обонятельными луковицами с помощью шпателя.

После этого отрежьте самую переднюю треть мозга и удалите её. Затем с помощью томильщика для тканей нарежьте ткани мозга корональными срезами толщиной 1.4 millimeter. Перенесите срезы в чашку с холодным диссекционным раствором.

Затем осмотрите срезы под диссекционным микроскопом. Осторожно разделите их с помощью иглы. Ростральный миграционный поток выглядит как треугольная полупрозрачная область в центре срезов OB и как небольшая круговая область.

В дополнительных срезах мозга вырежьте RMS из каждого среза микрохирургическим ножом, стараясь не захватить окружающие ткани. Затем соберите фрагменты RMS пластиковой пастеровской пипеткой и поместите их в небольшую чашку с холодным средом для диссекции на льду. После этого осторожно вращайте чашку, чтобы собрать фрагменты RMS в центре.

Соберите фрагменты пластической пипеткой и перенесите их в пробирку объемом 15 миллилитров. Оставьте фрагменты осесть на дно пробирки. Замените среду для диссекции двумя миллилитрами среды для диссоциации T tri.

Равномерно распределите фрагменты RMS, аккуратно пропипетировав суспензию фрагментов примерно 10 раз с помощью пипетки P 1000. Поместите пробирку с фрагментами ткани в водяную баню при температуре 37 °C на две минуты. После этого снова пропипетируйте раствор 10 раз и убедитесь, что фрагменты разошлись.

Затем инактивируйте трипсин, добавив пять миллилитров предварительно подогретого DMEM с 10% FCS, и центрифугируйте клеточную суспензию при 433 ×g в течение пяти минут. Удалите избыток среды и ресуспендируйте клеточный осадок, аккуратно перенося его пипеткой в один миллилитр предварительно подогретого DMEM с 10% FCS, после чего добавьте еще четыре миллилитра той же среды.

Затем проведите подсчет клеток. Для каждой нуклеофекции требуется минимум 2.5 × 10⁶ клеток, а оптимальные результаты достигаются при использовании от 3 до 4 × 10⁶ клеток на одну нуклеофекцию.

Центрифугируйте суспензию клеток при 433 ×g в течение пяти минут. После этого максимально удалите среду. Сразу же ресуспендируйте осадок клеток в предварительно инкубированном растворе для нуклеации нейронов крысы.

При комнатной температуре перенесите 100 µL клеточной суспензии в каждую пробирку EOR, содержащую SI R-N-A-D-N-A. Затем осторожно перемешайте содержимое, два-три раза пропипетировав раствор пипеткой P 200. После этого добавьте образец на дно куветты для нуклеаффекции, стараясь не создавать пузырьков воздуха.

Для нуклеафекции используйте программу G-013 для клеток крысы или O-005 для клеток мыши. После этого быстро добавьте 1 mL предварительно подогретой среды DMEM с добавлением 10% FCS к образцу после нуклеафекции. Перенесите образец в пробирку объемом 15 mL, содержащую 5 mL предварительно подогретой среды DMEM с добавлением 10% FCS, используя пластиковую пипетку из набора для нуклеафекции.

Затем центрифугируйте образец при 433 ×g в течение пяти минут. Осторожно удалите весь избыток среды и ресуспендируйте осадок в 25–30 µL предварительно подогретого DMEM с добавлением 10% FCS, используя дозатор P 20. Не используйте более 30 µL среды.

Затем нанесите суспензию каплей на внутреннюю сторону крышки чашки P 35. После этого переверните крышку над чашкой P 35, содержащей 2 mL полной среды. Оставьте чашку в инкубаторе при 37 °C с 5% carbon dioxide минимум на пять часов.

Через пять часов перенесите висячие капли с крышки в полную среду в чашку, используя дозатор P 1000 с обрезанным наконечником. Затем инкубируйте образцы при 37 °C в атмосфере 5% carbon dioxide в течение 24 часов для ядерных инфекций DNA NU или 48 часов для ядерных инфекций SI A HRA.

Теперь приготовьте 25 миллилитров полной среды и предварительно уравновесьте её при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение нескольких часов. Тем временем извлеките замороженные аликвоты матрикса базальной мембраны из морозильника при -80 °C и разморозьте их на льду в холодном помещении. Для каждой нуклеации подготовьте чашку диаметром 6 см, содержащую до восьми стерильных покровных стекол диаметром 13 мм.

Поместите чашки на термоконтейнер с льдом, накрытый пищевой пленкой. Для поддержания влажности положите полоску влажной салфетки внутрь чашки диаметром 15 см, в которой будут размещаться до трех чашек диаметром 6 см с инкапсулированными в коленный матрикс областями. Затем добавьте полную среду к матриксу HAW в соотношении 1:3, перенесите реагрегированные клеточные кластеры в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 433 ×g в течение пяти минут.

После этого удалите избыток среды и ресуспендируйте осадок в 10 µL полной среды. Затем нанесите по 2 µL суспензии клеточных агрегатов на каждое стерильное покровное стекло. Добавьте 18 µL смеси полной среды с матриксом и с помощью наконечника пипетки распределите матрикс по всей поверхности стекла.

Сразу после этого поместите чашку диаметром 6 см с покровными стеклами в чашку диаметром 15 см. Перенесите чашку в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide на 15–20 минут. После затвердевания матрикса осторожно добавьте по 5 мл полной среды в каждую чашку диаметром 6 см и с помощью наконечника пипетки прижмите любые всплывшие покровные стекла, затем инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C и 5% carbogen, чтобы нейробласты могли мигрировать из клеточных агрегатов.

На этом рисунке показано, что изолированные клетки RMS крысы иммуноположительны по миграционным маркерам нейробластов DCX и бета-III-тубулину. Также на этом рисунке показано, что миграционные маркеры нейробластов DCX и PSA-NCAM экспрессируются в клетках, мигрирующих из RMS мыши. Для нуклеальной трансфекции нейробластов RMS мыши диссоциированные нейробласты RMS мыши были трансфецированы GFP, повторно агрегированы, помещены в трехмерный матрикс и оставлены для миграции на шесть часов.

Нейробласты, мигрирующие из повторно агрегированного клеточного кластера, демонстрируют высокую эффективность трансфекции. В данном эксперименте нейробласты крысы были трансфицированы двумя различными плазмидами, кодирующими GFP, повторно агрегированы, помещены в матрикс и оставлены для миграции на 24 часа. Затем клетки были фиксированы и подвергнуты иммуноокрашиванию на GFP и бета-III-тубулин для измерения расстояния миграции.

Агрегированный клеточный кластер разделяют на шесть равных секторов, и для каждого сектора измеряют расстояние от края кластера до самой удаленной мигрировавшей клетки. На этом рисунке представлена количественная оценка относительного расстояния миграции GFP-положительных клеток с подавленным экспрессией NUCLE и контрольных GFP-отрицательных клеток без подавления NUCLE для мониторинга миграции нейробластов. После воздействия shRNA на нейробласты крыс с использованием контрольного вектора shRNA или того же вектора, содержащего мишень для hRNA белка, связывающего фасцин и актин, клетки повторно агрегировали в течение 48 часов, заключая их в матрикс, после чего оставляли для миграции на 24 часа.

Затем агрегаты фиксировали и подвергали иммуноокрашиванию на GFP и бета-III-тубулин. Эффективное истощение Fascin можно обнаружить через 50 часов после инъекции shRNA в ядра с помощью вестерн-блот-анализа; актин здесь представлен в качестве контроля загрузки. Ниже приведен количественный анализ относительного расстояния миграции, показывающий, что истощение Fascin значительно нарушает миграцию нейробластов.

После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как постнатальная электропорация, для подтверждения in vivo результатов, полученных с помощью анализа миграции NU Nuclear Affection.