Nucleofection из грызунов нейробласты по изучению нейробласта миграции В пробирке

Общая цель этой процедуры заключается в трансфекции первичного постнатального нейробласта у грызунов с целью изучения влияния белков-мишеней на их миграцию. Это достигается путем предварительного препарирования нейробласта из рострального миграционного потока попс грызунов. Второй шаг состоит в том, чтобы диссоциировать их и трансфицировать путем поражения ядер либо ДНК, либо S-H-R-N-A.

Затем нейробласты повторно агрегируются в висячих каплях, а затем культивируются в суспензии в течение соответствующего времени. Последний шаг состоит в том, чтобы встроить реагрегированные кластеры нейробластов в трехмерную матрицу и оставить их для миграции. В конечном счете, для анализа миграции нейробластов используется иммунофлуоресцентная микроскопия или покадровая микроскопия.

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области нейрогенеза, такой как контроль миграции нейробластов, полученных из стволовых клеток, в постнатальном мозге. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она относительно проста и быстра по сравнению с использованием вирусных векторов, что может быть сложным и трудоемким. После того, как вы принесете в жертву крысиный помет от P 6 до P 7, сделайте задний разрез на коже вдоль среднего сагиттального шва от носа до мозжечка лезвием скальпеля на каждой крысе.

Далее снимите кожу. Повторите тот же разрез вдоль черепа. Затем аккуратно снимите щипцами черепные лоскуты и аккуратно удалите мозг вместе с обонятельными луковицами с помощью шпателя.

После этого отрежьте самую побалованную треть мозга и выбросьте ее. Затем измельчите ткань мозга на корональные срезы толщиной 1,4 миллиметра с помощью измельчителя тканей. Переложите ломтики в блюдо со средой для холодной диссекции.

Затем просмотрите срезы под микроскопом для вскрытия. Аккуратно отделите их с помощью иглы. Ростральный миграционный поток проявляется в виде треугольной полупрозрачной области в центре участков OB и в виде небольшой круглой области.

В более сложных срезах мозга вырежьте RMS из каждого среза микрохирургическим ножом, стараясь не включать окружающие ткани. Затем соберите фрагменты RMS с помощью пластиковой пастерной пипетки и поместите их в небольшую чашку, содержащую на льду среду для холодной диссекции. Затем аккуратно поверните тарелку, чтобы собрать фрагменты RMS в центре тарелки.

Соберите фрагменты с помощью пластиковой пипетки и перенесите их в пробирку объемом 15 миллилитров. Оставьте осколки осесть на дне трубки. Замените диссекционную среду двумя миллилитрами диссоциативной среды T tri.

Оцените среднеквадратичные фрагменты, осторожно дозируя суспензию фрагментов вверх и вниз около 10 раз с помощью пипетки P 1000. Оставьте трубку с фрагментами ткани на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия на две минуты. Затем еще раз пипетируйте раствор 10 раз и убедитесь, что фрагменты диссоциировали.

Затем инактивируйте трипсин, добавив пять миллилитров предварительно червистого DMEM плюс 10% FCS, и центрифугируйте клеточную суспензию при 433 G в течение пяти минут. Удалите излишки среды и восстановите ее. Суспензируйте клеточную гранулу, аккуратно пипетируя ее в одном миллилитре предварительно подогретого DMEM плюс 10% FCS, а затем добавьте еще четыре миллилитра той же среды.

Затем выполните подсчет клеток. Для поражения каждого ядра требуется минимум 2,5 умножить на 10 до шестой клетки, пока не достигаются оптимальные результаты. Используя три-четыре умножить на 10 до шести клеток на одно ядро.

Центрифугируйте клеточную суспензию при 433 умноженных на G в течение пяти минут. После этого удалите как можно больше среды в этой процедуре. Немедленно Резус, суспензируйте клеточную гранулу в растворе для поражения ядра нейрона крысы, предварительно инкубированном.

При комнатной температуре переведите 100 микролитров клеточной суспензии в каждую пробирку с МУН, содержащую SI R-N-A-D-N-A. Затем осторожно перемешайте его с помощью пипетки два-три раза с помощью пипетки P 200. Затем добавьте образец на дно ядра поражения вете, стараясь не образовывать пузырьков.

Для поражения ядра используйте программу G dash 0 1 3 для клеток крысы или O dash 0 0 5 для клеток мыши. После этого быстро добавьте один миллилитр довоенного DMEM плюс 10% FCS в образец пораженного ядра. Перенесите образец в пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую пять миллилитров довоенного DMEM плюс 10% FCS, с помощью пластиковой пипетки, входящей в комплект для поражения ядер.

Затем центрифугируйте образец при 433-кратном G в течение пяти минут. Осторожно удалите всю лишнюю среду и повторно суспендируйте гранулу в дозаторе от 25 до 30 микролитров довоенного DMEM плюс 10% FCS с помощью пипетки P 20. Не используйте более 30 микролитров среды.

суспензию в виде капли на внутреннюю сторону крышки для посуды P 35. Затем переверните крышку над посудой Р 35, содержащей два миллилитра готовой среды. Оставьте его в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом не менее чем на пять часов.

Через пять часов переложите свисающие капли с крышки в готовую среду в посуде. С помощью пипетки P 1000 с обрезанным наконечником. Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение 24 часов для ядерных инфекций ДНК NU или 48 часов для поражения ядер SI A HRA.

Теперь приготовьте 25 миллилитров полной среды и предварительно уравновесьте при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение нескольких часов. Тем временем достаньте замороженные аликвоты матрицы базальной мембраны из морозильной камеры с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия и разморозьте их на льду в холодильной камере. Для каждого поражения ядра приготовьте шестисантиметровую чашку, содержащую до восьми 13-миллиметровых стерильных покровных листов.

Поставьте посуду на холодильник, накрытый пищевой пленкой. Чтобы поддерживать влажность, поместите полоску влажной ткани внутрь 15-сантиметровой посуды, которая будет использоваться для хранения до трех шестисантиметровых тарелок, содержащих области коленного сустава. Затем добавьте полную среду в матрицу haw в соотношении один к трем, перенесите повторно агрегированные кластеры клеток в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте ее в 433 раза больше G в течение пяти минут.

После этого удалите лишнюю среду и снова подвесьте поддон в 10 микролитрах готовой среды. Затем поместите два микролитра суспензии клеточного агрегата на каждую стерильную покровную крышку. Добавьте 18 микролитров матрикса в полную среднюю смесь и с помощью наконечника пипетки распределите матрицу по всей крышке.

Сразу после этого поместите шестисантиметровую тарелку с крышкой в 15-сантиметровую посуду. Перенесите чашку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на 15-20 минут. После того, как матрица застынет, осторожно добавьте пять миллилитров полной среды в каждую шестисантиметровую чашку и нажмите на все плавающие крышки с помощью наконечника пипетки, затем инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия с 5% карбогена, чтобы позволить нейробласту мигрировать из клеточных агрегатов.

На этом рисунке показано, что выделенные клетки RMS крысы иммунопозитивны к мигрирующим маркерам нейробластов DCX и бета-3 тубулину. И этот рисунок показывает, что мигрирующие маркеры нейробластов DCX и PSA NCA экспрессируются в клетках, мигрирующих из мыши. RMS Explan для мышей Neuroblast Nu nuclear aff, диссоциированные мышиные RMS Neuroblast были поражены ядрами GFP, агрегированными в трехмерную матрицу и допущенными к миграции в течение шести часов.

Нейробласты, мигрирующие из реагрегированного клеточного кластера, демонстрируют высокую эффективность трансфекции. Здесь нейробласты крысы были поражены ядром двумя различными плазмидами, кодирующими GFP, агрегированными в матрицу и оставленными мигрировать на 24 часа. Затем клетки были зафиксированы и иммуноокрашены на GFP и бета-3 тубулин для измерения расстояния миграции.

Агрегированный кластер ячеек делится на шесть равных секторов, и для каждого сектора измеряется расстояние между краем кластера и самой дальней мигрирующей ячейкой. На этом рисунке показана количественная оценка относительного расстояния, мигрирующего GFP-положительными клетками, пораженными NUCLE, и контроль GFP-отрицательных клеток, не пораженных ядром, для мониторинга миграции нейробластов. После поражения S-H-R-N-A Nucle нейробласты крысы были поражены ядром контрольного вектора S-H-R-N-A или того же вектора, содержащего белок-мишень HRNA и связывание актина, клетки повторно агрегировали в течение 48 часов, встраивали в матрикс и оставляли мигрировать на 24 часа.

Затем агрегаты фиксировали и иммуноокрашивали на GFP и бета-3 тубулин. Эффективное истощение крепления может быть обнаружено через 50 часов после поражения ядер S-H-R-N-A с помощью западного анализа крови, и актон показан здесь в качестве контроля нагрузки. Вот количественный анализ относительного расстояния миграции, показывающий, что прикрепленное истощение значительно ухудшает миграцию нейробластов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как постнатальная электропорация, для подтверждения in vivo результатов, полученных с помощью анализа миграции ядерного поражения NU.