Идентификация мышиный эритробласта субпопуляции обогащенный энуклеирующий События на нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы облегчить идентификацию событий энуклеации с субпопуляцией аурных эритробластов. Первым шагом является создание популяции, обогащенной нуклеативными событиями. Это достигается путем культивирования эритропоэза in vitro, либо долгосрочного, начиная с клеток костного мозга низкой плотности, выделенных из бедренных, большеберцовых и тазовых костей мыши, не подвергающейся стрессу, либо краткосрочного культивирования.

Начиная с цитов из селезенки мыши, ранее подвергшейся флеботомии, для создания стрессового эритропоэза. Культивируемые клетки на заключительном этапе культивирования фиксируют, пронизывают и окрашивают флуоресцентными маркерами, представляющими интерес. Эти клетки прогоняют на проточном цитометре, а затем анализируют для идентификации клеток, подвергающихся энуклеации в популяции нуклеирующих клеток, могут быть идентифицированы сигнальные и цитоскелетные компоненты, которые регулируют и опосредуют процесс энуклеации.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как флуоресцентная микроскопия, заключается в том, что за короткий промежуток времени можно наблюдать и анализировать значительно большее количество зародышевых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области эритропоэза, например, какие молекулярные механизмы участвуют в зарождении эритробластов. Дифференцировать эритроидные клетки из клеток костного мозга низкой плотности начинают с добавления одного миллилитра питательной среды в стерильную пробирку проточной цитометрии.

Затем прикрепите иглу размером 25 на пять восьмых дюйма к туберкулиновому шприцу и аккуратно промывайте свежую питательную среду через собранные бедренные и большеберцовые кости несколько раз в проточную цитометрическую трубку. После регулировки объема клеточной суспензии до пяти миллилитров с помощью IMDM, осторожно нанесите на пять миллилитров среду для разделения клеток с градиентом плотности 1,083 грамма на миллилитр в 15-миллилитровую пробирку. Переложите все до отметки в два миллилитра в новую 15-миллилитровую пробирку и промойте собранную охристую шерсть свежей питательной средой вшей, эритроциты в трех миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов в течение пяти минут при комнатной температуре после промывки клеток в культуральных средах и ресуспензии гранулы в той же тарелке, клетки в шестилуночном планшете для культивирования клеток в концентрации в пять раз по 10-й части пятой клетки на лунку до конечного объема 2,5 миллилитров в питательных средах и инкубируют клетки при 37 градусах Цельсия через пять дней после нанесения культуры.

Подсчитайте количество эритробластов в каждой лунке исходной культуральной пластины, а затем перенесите каждую лунку в соответствующие отдельные 15-миллилитровые конические пробирки. После раскрутки клеток аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы в свежих питательных средах, содержащих только эритропоэтин, до концентрации в два раза больше 10 пятых клеток на миллилитр. Затем аспирируйте надосадочную жидкость из пластины с пятью клетками МС и добавьте эритроидные клетки в лунки.

Через два дня замените надосадочную жидкость свежей питательной средой без цитокинов для очистки эритробластов из PLE-цитов низкой плотности. С помощью поршня из пятимиллилитрового шприца размачивайте селезенку через ситечко 40 микрон в трубку объемом 50 миллилитров. Промойте клеточное ситечко питательной средой и отрегулируйте итоговый объем клеточной суспензии до пяти миллилитров.

Затем, разделив клеточные слои по градиенту плотности, как показано выше, удалите эритроциты и промойте циты в семи миллилитрах питательных сред. Затем Резус суспендирует гранулу в питательной среде с добавлением цитокинов и инкубирует клетки при одной-пяти умноженных на 10-6 клетках в окончательном объеме один миллилитр на лунку 24-луночного клеточного планшета в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день.

Перенесите клетки в лунки, содержащие прилипшие пять клеток МС, как описано ранее, и проанализируйте через шесть-восемь часов, соберите эритобласты из культуральных лунок и зафиксируйте их в 500 микролитрах 3,7%-ного формальдегида в PBS Resus, суспендируя гранулу с помощью щадящего пипетирования. Через 15 минут вращайте клетки при давлении 2000 GS в течение 20 секунд в микроцентрифуге, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах PBS. После вращения клеток в микроцентрифуге, снова отасуньте надосадочную жидкость и поместите клетки на лед не менее чем на 15 минут.

Поставьте минус 20 градусов по Цельсию, хранящиеся растворы ацетона на льду. Затем быстро ресуспендируйте и закрутите клетки в серии промывок ацетоном, как показано после промывки буфера факса, инкубируйте клеточные гранулы в 100 микролитрах соответствующего коктейля антител в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем, после повторной промывки клеток в факс-буфере, повторно суспендируйте устойчивые гранулы в 60 микролитрах факс-буфера, содержащего drac 5, и прогоните образцы на проточном цитометре, собирая не менее 10 000 событий для каждого экспериментального образца.

Затем начните анализ с выбора ячеек на основе их соотношения сторон светлого поля, отношения длины их малой и большой оси и их светлой области, которая указывает на их размер. События со значением области светлого поля ниже 20 и выше 200 в основном представляют собой скопления мусора и ячеек соответственно и исключены из анализа. Затем анализируются отдельные ячейки на основе их значения для параметра градиента RMS, который указывает на резкость изображения, создается второй вентиль, содержащий ячейки со значением среднеквадратичного градиента больше 50-го процентиля, чтобы выбрать изображения, сделанные хорошо в фокусе.

Следующий вентиль, клетки, основанные на их размере, измеренном по их светлопольной площади, и их положительном отношении к эритроидному маркеру TER one 19, измеренному по среднему параметру флуоресцентного окрашивания TER one 19, очень низкому или очень высокому для TER one 19, являются либо неэритроидными, либо оставшимися клеточными агрегатами соответственно и исключены из анализа на следующем этапе. Клетки отбираются на основе их интенсивности отношения DR пять аспектов, отношения малой и большой оси их ядра и интенсивности их экспрессии d dr 5. DR пять отрицательных клеток, в основном энуклеированные клетки, такие как ретикулоциты и эритроциты, а также клетки с низким коэффициентом сопротивления и пяти аспектов.

В основном дублеты исключаются из анализа аллюра. Они перетягивают пять положительных ДНК-положительных клеток, которые на данный момент в основном являются эритробластами. Затем эти эритобласты анализируются на основе их площади TER one 19, которая указывает на размер клетки, и их средней площади пикселя TER one 19 или плотности экспрессии TER one 19, которая указывает на яркость их окрашивания TER one 19.

Ортохроматические эритробласты распознаются как малые TER с 19 высокими клетками. Наконец, субпопуляция ортохроматических эритробластов характеризуется их низким соотношением сторон в светлом поле и высоким дельта-сенту XY TUR one 19. DR пять, определяется расстоянием между центром зарождающегося TUR one 19 положительного ретикулоцита и центром DR five положительного ядра вместе с антителом против нее one one 19 и ДНК окрашивания DRAAK 5.

Клетки обычно также окрашивают для определения локализации factin во время эритробластов и зародышеобразования. Следует отметить, что прогрессирование энуклеации можно визуализировать в виде клеток с убывающим аспектным отношением. То есть клетки, которые становятся все более вытянутыми и с увеличением дельта OID xy TUR наблюдаются 19 drag five.

F-актин концентрируется в борозде расщепления во время зародышеобразования, а затем рассеивается после выдавливания ядра. Другие белки и структуры, представляющие интерес, также могут быть окрашены соответствующими антителами или флуоресцентными маркерами, чтобы обеспечить визуализацию их роли во время энуклеации. Например, образование поляризованных микротрубочек может быть визуализировано в ортохроматических эритробластах дикого типа до зарождения, но не в эритробластах, обработанных колхицином.

Ингибирование полимеризации тубулина колхицином уменьшает поляризацию клеток, как показано при измерении параметра дельта OID XYB FDR 5 между центром тела клетки, видимым в канале Brightfield, и центром ядерного окрашивания, достигнутого с помощью DR 5. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как флуоресцентная микроскопия, чтобы ответить на вопросы, касающиеся взаимодействий между различными типами клеток, участвующими в эритропоэзе, например, которые наблюдаются в островках эритробластов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать события энуклеации в популяции, обогащенной эритробластами.