Выделение жизнеспособных многоклеточных желез от ткани Хищные растения, Nepenthes

Целью представленного метода является получение единичных и чистых желез из свежей растительной ткани для молекулярного анализа. Для этого сначала собирают кувшин растения nepenthe. Затем ткань фиксируют непосредственно на платформе для микроотбора проб на льду, чтобы сохранить её свежесть.

В ходе процедуры микроотбора образцов железы изолируются точным способом и переносятся в ПЦР-пробирку перед проведением количественного ПЦР-анализа собранного материала. В конечном итоге технология механического микроотбора используется для получения одиночных и чистых желез растений-напес, чтобы быстро и микроинвазивно получить специфическую ткань для дальнейшего молекулярного анализа. Растения-хищники являются специализированными представителями флоры, поскольку они способны переваривать животный белок.

Наши знания о том, как это работает на молекулярном уровне, все еще ограничены. Хорошей моделью для изучения этого вопроса является структура червеобразного отростка, поскольку он состоит из различных тканей и содержит железы, которые участвуют в процессах пищеварения в аппендиксе.

Эти железы расположены внутри структур, показанных на изображениях ниже. Для молекулярного анализа необходимо выделить эти широкие и плоские структуры диаметром примерно от 100 до 200 микрометров непосредственно из свежей ткани. Дополнительную сложность представляет то, что железы покрыты защитным капюшоном.

Из-за структуры, напоминающей навес, при отборе проб требовалось проведение трехмерных наблюдений, а также инструмент, способный аккуратно перемещаться в трех измерениях. Мы обнаружили, что существующие методы микродиссекции не предназначены для решения наших задач. Например, использование лазера оказалось неэффективным из-за высокого содержания воды в растительной ткани.

Поэтому мы решили применить новый метод механической микродиссекции под названием aika, а именно для выделения фрагментов тканей или даже отдельных клеток 3D-структур. Он представляет собой стереомикроскоп или сканирующий микроскоп со встроенным 3D-микроманипулятором, который позволяет легко достигать как очень плоских, так и очень высоких объектов. Манипулятор перемещается вместе с микроскопом как единая стойка; для забора образцов растений мы часто используем микрокапилляры.

Однако в случае с аппендиксом мы обнаружили, что микропинцеты с ПИД-регулированием работают более эффективно для нашей процедуры. Для работы с аппендиксом платформа была модифицирована. Компактный VXY-столик поддерживает контейнер с льдом, размер которого достаточен для размещения как образца ткани с держателем, так и места, куда будет помещена железа.

Лед обеспечивает достаточное замедление процессов деградации в ткани, чтобы можно было зафиксировать ее исходное молекулярное состояние. Следующая процедура была установлена на основе нижней части изображения. Вырезают фрагмент площадью примерно один-два квадратных сантиметра, после чего его расправляют.

Затем ткань фиксируют на предметном стекле с помощью двустороннего скотча. Образец ткани покрывают безнуклеазной водой и поддерживают во влажном состоянии в процессе отбора проб. Затем образец позиционируют так, чтобы железы и защитные капюшоны были обращены в сторону манипулятора.

Необходимо отрегулировать угол между образцом и инструментом так, чтобы железы лежали плоско. С помощью универсального предметного столика можно настраивать наклон по двум осям и легко корректировать его под микроскопом. Металлический столик позволяет поддерживать образец в охлажденном состоянии при нахождении под микроскопом.

Железы четко дифференцируются. Флуоресценция позволяет легко определить контуры как железы, так и защитного капюшона. Образец наблюдают через фильтр FSE для выделения желез.

Для экстракции РНК используется УФ-фильтр. Для изоляции железы крайне важно очень точное позиционирование микропинцета. Рекомендуется использовать инструмент в режиме низкой скорости.

С помощью микропинцета приближаются к железе, затем с помощью джойстика зажимают ее края, аккуратно смыкая бранши микропинцета. После этого железу приподнимают над окружающими тканями. После точной изоляции становится видна неповрежденная полость, в которой просматривается подлежащая сосудистая ткань.

Затем изолированную железу переносят в ПЦР-пробирку и помещают в подготовленный буфер. Для валидации данного метода был определен уровень экспрессии гена белка atoma leg protein short, TAP, который секретируется в смолистую жидкость; было установлено, что ген может быть амплифицирован непосредственно из желез без предварительной экстракции геномной ДНК путем простого добавления реакционной смеси для ПЦР к изолированной ткани.

Серия экспериментов включала железы растений рода Nepenthes, подвергнутых различным видам обработки, а также образцы окружающей их эпидермальной ткани. Для каждого эксперимента была выделена общая РНК. Полученная мРНК была переведена в соответствующую кДНК с помощью обратной транскрипции и использована для последующей ПЦР-реакции.

Для амплификации интересующей последовательности гена использовали ПЦР в реальном времени, чтобы сравнить уровень экспрессии TLP в железах и эпидермисе nepenthes. Результаты показывают, что уровень транскриптов TLP выше в секреторных железах по сравнению с эпидермальной тканью как у nepenthes allotta, так и у nepenthes miis, что подтверждается соотношением эпидермальной ткани к ткани железы менее единицы; данный анализ проводился для проверки того, может ли контакт с добычей индуцировать экспрессию гена. После захвата добычи сравнивали уровни транскриптов TLP, а также изображения необработанных образцов и образцов, которым скармливали drosophila melan gaster.

В эпидермальной ткани наблюдалась более высокая экспрессия TLP. Было проведено сравнение уровней транскриптов TLP в железах и эпидермальной ткани, а также представлено изображение обработанного растения nepenthes miis. Повышение экспрессии TLP в обоих типах тканей указывает на то, что выработка белков жидкости кувшинчика действительно может быть индуцирована добычей.

Результаты ПЦР свидетельствуют о том, что кормление эффективно изменяет экспрессию TLP в обоих типах тканей и может смещать соотношение экспрессии между железой и эпидермисом. Мы разработали эффективный метод получения очищенного материала из тканей придатка FA и выделили достаточное количество мРНК для проведения экспериментов по экспрессии генов. С помощью разработанного нами нового метода становится возможным изучение не только транскриптомики желез придатка, но также метаболомики и протеомики.