Оценка Миогенный ответ и вазоактивности В Сопротивление брыжеечных артерий, используя миография давления

Общая цель данной процедуры заключается в определении влияния фармакологического агента или патологического состояния на индуцированный давлением сосудистый тонус в мелких резистивных брыжеечных артериях. Для этого сначала изолируют брыжеечную аркаду из мышиной модели. На втором этапе проводят препарирование мелких резистивных артерий четвертого порядка.

Следующими этапами являются канюляция, создание давления и инкубация артериального препарата. В PSS заключительным этапом является оценка физиологической целостности артериального препарата, которая подтверждается спонтанным развитием сосудистого тонуса и соответствующим обратимым ответом на вазоконстриктор и вазодилататор. В конечном итоге можно измерить констрикцию, вызванную давлением.

Применение данной методики может быть распространено на терапию или диагностику гипертензии, гипотензии или сосудистой дисфункции. Это обусловлено тем, что данный метод позволяет выявить ключевые механизмы, лежащие в основе индуцированных давлением изменений сосудистого тонуса, который является основным определяющим фактором сосудистого сопротивления, перфузии и артериального давления. Процедуру продемонстрирует доктор Jja, постдокторант нашей лаборатории.

Начните выполнение данной процедуры с установки стеклянной канюли в держатель микропипетки и закрепления держателя микропипетки в перфузионной камере для её подготовки. Промойте камеру водой Milli Q, а затем раствором для диссекции, по пять минут соответственно. После этого наполните камеру двумя миллилитрами раствора для диссекции.

Затем осторожно заполните всю канюлю и присоединенную к ней трубку, избегая образования пузырьков воздуха. С помощью тупоконечных пинцетов под диссекционным микроскопом подготовьте две лигатуры, завязав на каждой по половинчатому узлу. Используя диссекционные пинцеты, введите в обе канюли частично затянутые узлы лигатур, располагая их чуть выше кончика.

Затем на анестезированной крысе выполните срединную лапаротомию от таза до грудины, сначала сделав разрез кожи, а затем разрез подлежащего мышечного слоя. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить органы брюшной полости. Оба конца кишечника следует перевязать по отдельности, чтобы предотвратить вытекание химуса и фекалий и избежать загрязнения внеклеточного раствора для бани.

После этого отсеките проксимальный конец кишечника рядом с порами и дистальный конец рядом с илеоцекальным соединением. Затем сделайте разрез брыжейки у ее основания в области питающих сосудов. Далее перенесите все брыжеечное ложе тонкого кишечника в стакан объемом 50 мл с ледяным диссекционным раствором и инкубируйте в течение пяти минут.

Затем промойте его свежим раствором для диссекции, чтобы удалить кровь. Теперь закрепите проксимальный конец кишечника с правой стороны в чашке с салфеткой, растягивая оставшуюся часть кишечника против часовой стрелки. Закрепите сегмент, чтобы расправить брыжейку и обнажить кровеносные сосуды под стереомикроскопом.

Препарируйте мелкие мезентериальные артерии третьего и четвертого порядков, идущие параллельно тонкому кишечнику, предварительно удалив весь покрывающий жир в области ветви второго порядка. Затем препарируйте вену и изолируйте артерию с V-образным местом разветвления. Будьте осторожны, чтобы не проколоть выбранный сегмент.

Затем изолируйте участок артерии длиной 4–5 мм, расположенный параллельно тонкому кишечнику. Перережьте все ветви пятого порядка, входящие в тонкий кишечник, немного удаляясь от места их отхождения, и сохраните эти фрагменты. Данные участки будут служить точками фиксации при переносе сегментов артерии в перфузионную камеру и в дальнейшем будут использованы для их канюляции.

Затем вырежьте сегменты артерий, сделав два разреза дистальнее ветвей пятого порядка с каждой стороны артерии, и перенесите их в перфузионную камеру. Канюлируйте один конец сосудов с помощью стеклянной микропипетки, удерживая кончик сегмента артерии диссекционными пинцетами. Наденьте предварительно заготовленную частично затянутую лигатуру на канюлированный конец и зафиксируйте ее.

Затем подсоедините к стоп-крану этой канюли шприц объемом 10 миллилитров, заполненный раствором для диссекции. Осторожно поднимите шприц. Под действием силы тяжести раствор удалит кровь из открытого конца сосуда.

После удаления внутриартериальной крови закройте кран. Теперь привяжите дистальный конец сосудов ко второй стеклянной канюле, осторожно совместив вторую канюлю с незакрепленным концом артериального сегмента. Наденьте заранее заготовленный, частично затянутый шов на конец с канюлей и зафиксируйте его.

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не дергать и не растягивать артериальные сегменты, а также убедиться, что стоп-коки, прикрепленные к обеим канюлям, закрыты. Перенесите перфузионную камеру на предметный столик инвертированного микроскопа, оснащенного системой записи видео в реальном времени. Затем подключите стоп-кок канюли, прикрепленной к проксимальному концу артериального сегмента, к устройству регулирования давления с сервоприводом.

Убедитесь, что кран, прикрепленный к другой канюле, остается закрытым для поддержания стабильного внутрипросветного давления. Затем подсоедините вакуумную трубку к перфузионной трубке, а всасывающий порт — к перфузионному порту камеры. Начните перфузию сосуда теплым PSS через одноканальный поточный нагреватель раствора со скоростью 2 мл/мин.

Используя перистальтический насос, включите вакуум, когда температура PSS в камере приблизится к 37 °C. Медленно увеличьте внутрипросветное давление с 20 до 100 мм рт ст. Проверьте сосуд на наличие утечек, используя автоматическую настройку давления регулятора давления.

После этого проверьте артериальный сегмент на наличие изгибов, поддерживая давление на уровне 100 мм рт ст. С помощью винтового рычага переместите канюлю, чтобы выпрямить артериальный сегмент, избегая его чрезмерного растяжения. Затем снизьте давление до 70 мм рт ст, чтобы имитировать давление in vivo в мезентериальной аркаде, и дайте артериальному сегменту стабилизироваться и развить миогенный тонус.

В данной процедуре исследуйте артерию с помощью объектива 10x под микроскопом, оснащенным монохромной видеокамерой. Подключите камеру к устройству. Измерьте диаметр просвета, используя систему захвата видеокадров и систему обнаружения границ в реальном времени.

Затем зафиксируйте диаметр сосуда и проследите за развитием миогенного тонуса. После этого снизьте давление до 20 мм рт ст и дождитесь стабилизации диаметра. Затем ступенчато повышайте внутрипросветное давление (например, до 20, 40, 60, 80 и 100 мм рт ст), позволяя артерии достичь стабильного диаметра при каждом значении давления.

На следующем этапе повторите исследование реакции на скачок давления в бескальциевом PSS, содержащем 0,39 мМ EGTA и 0,1 мМ нитропруссида натрия; как показано на кривой, диаметр малых брыжеечных артерий крыс спонтанно уменьшается при создании давления 70 mmHg. Добавление 1 µM ацетилхолина увеличило диаметр почти до исходного значения. Добавление 1 µM фенилэфрина в ванну с тканью привело к уменьшению диаметра артерии, а на данном рисунке показано, что инкубация малых брыжеечных артерий в бескальциевом PSS увеличивает диаметр артерии. В данной таблице представлен диаметр одного сегмента артерии под давлением при различных скоростях перфузии.

Здесь диаметр артерии регистрируется непрерывно при постепенном увеличении внутрипросветного давления в присутствии PSS и PSS без кальция. Здесь представлены кривые диаметра артерии, полученные на каждом этапе повышения давления, а также гистограмма миогенного тонуса, достигнутого на каждом этапе повышения давления. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать миогенное поведение малых резистентных артерий.

После применения данной методики можно провести дополнительные процедуры, такие как повреждение эндотелия и артериальная пермеация. Обе эти процедуры позволяют получить ответы на дальнейшие вопросы, касающиеся роли эндотелия и кальция в регуляции сосудистого тонуса малых резистивных артерий.