Гельминтами Сбор и определение от дикой природы
14 декабря 2013 г.
Дикие животные обычно паразитируют на широком спектре гельминтов. Четыре основных типа гельминтов - это "круглые черви" (нематоды), "колючие черви" (акантоцефалы), "сосальщики" (трематоды) и "ленточные черви" (цестоды). Здесь мы описываем, как гельминты собираются у позвоночного животного, как они сохраняются и таксономически идентифицируются.
Общая цель данной процедуры заключается в сборе, сохранении и идентификации гельминтов из диких животных. Для этого сначала проводится некропсия дикого животного. Затем гельминты собираются из различных органов, после чего они подвергаются консервации с использованием различных методов для последующей идентификации.
Наконец, шлемы осветляют, окрашивают, монтируют, после чего определяют вид. В конечном итоге с помощью методов осветления и/или окрашивания можно получить результаты, демонстрирующие специфические структуры шлема, что может существенно помочь в идентификации видов. Данный метод может быть применен для идентификации шлемов млекопитающих, птиц, рептилий и амфибий.
Этот метод также может быть применен для других организмов, например, рыб. Для начала поместите животное на плоскую поверхность и с помощью увеличительного стекла осмотрите все наружные отверстия, включая ушные раковины, ротовую полость и глаза, на предмет наличия нематод, CSE, клещей и трематод. Используйте острое лезвие или нож и dissecting forceps.
Сделайте разрез над брюшной полостью, стараясь не повредить органы. Затем с помощью костных кусачек или, при необходимости, небольшого ручного пилы, вскройте грудную полость. Осмотрите обе полости на наличие fal, круглых червей и крупных трематод.
Затем завяжите нить у начала пищевода и еще одну в конце толстой кишки для последующего исследования. Под стереомикроскопом перенесите сердце и крупные кровеносные сосуды, трахею и легкие в отдельные чашки Петри. Извлеките печень, желчный пузырь и протоки поджелудочной железы, селезенку, почки и мочевой пузырь, после чего изучите их под стереомикроскопом.
Затем извлеките всю пищеварительную систему и поместите каждый ее отдел в стеклянное блюдо. После извлечения органов промойте полость тела с помощью шланга или сквирт-бутылки, наполненной 0,9% saline, пропуская жидкость через сито с ячеями 106 микрометров. Перенесите содержимое сита обратным промыванием в чашку Петри и исследуйте его под стереомикроскопом на наличие нематод или трематод крови. С помощью ножниц вскройте каждый отдел пищеварительного тракта.
Соскребите слизистую оболочку и тщательно осмотрите её на наличие крупных паразитов. Головки паразитов часто глубоко встроены в стенку кишечника. Поэтому, при необходимости, используйте пинцет и/или маленькие ножницы, чтобы осторожно извлечь их из ткани.
Поместите каждую вскрытую полость под проточную воду и промойте содержимое через сито с размером ячеек 106 мкм. Затем вскройте сердце и основные кровеносные сосуды, трахею, мочевой пузырь и желчный пузырь, после чего обследуйте их содержимое. Аналогичным образом, используя острое лезвие и пинцет, разрежьте и разделите плотные органы, такие как печень, легкие, почки, селезенка и поджелудочная железа, промойте и обследуйте их содержимое. Зафиксируйте виды обнаруженных паразитов.
Подсчитайте количество особей каждого типа и определите органы, в которых они находятся. Маркируйте пробирки или флаконы, поместив внутрь небольшой кусочек простой индексной карточки с надписью, сделанной карандашом, чтобы сохранить шлемы для последующих генетических исследований. Сначала поместите их непосредственно в этанол.
После фиксации образца в течение одного или нескольких дней перенесите его в стеклянный флакон объемом 5 мл, заполненный 70% ethanol, для длительного хранения. Для сохранения Trematodes поместите живых особей на предметное стекло микроскопа в каплю физиологического раствора, накройте покровным стеклом и быстро проведите стекло через пламя, не доводя физиологический раствор до кипения. Затем поместите предметное стекло в чашку Петри, содержащую спирт, формин, уксусную кислоту или FA-фиксатор, и дайте покровному стеклу отделиться.
Зафиксируйте погибших трематод в FA или 10% буферном формалине в течение 48 часов, после чего перенесите их в банку с 70% этанолом для длительного хранения. Для фиксации живых особей сначала подвергните их релаксации в чашке Петри, полив почти кипящей водой, а затем перенесите в банку с 70% этанолом для длительного хранения. Релаксацию живых цефалокод проведите, поместив их в чашку Петри с водопроводной водой в холодильник на один или несколько часов до полного втягивания хоботка.
Перенесите их в банку с 70% этанолом или в раствор формальдегида (FA) для длительного хранения. Малых или хрупких нематод подвергните воздействию горячего 70% этанола и законсервируйте в банке с 70% этанолом и 5% глицерином для фиксации. Нематод среднего и крупного размера.
Поместите их в холодную ледяную уксусную кислоту, а через 15 минут перенесите в банку, наполненную 70% ethanol и 5% glycerin. Приготовьте гематин по Харрису, растворив гематин в спирте, а сульфат алюминия-аммония — в перегретой воде. Смешайте оба раствора и доведите до кипения.
Затем добавьте иодат натрия и кипятите в течение двух-трех минут. После охлаждения раствора отфильтруйте его через фильтровальную бумагу № 5 41, чтобы выделить трематод, и слейте надосадочную жидкость. Поместите образцы в гематин Харриса или семикармин на ночь для окрашивания. Храните в 70% кислотном этаноле до тех пор, пока органы не станут видимыми.
Чтобы остановить окрашивание, перенесите образцы в 70% basic ethanol минимум на 30 минут. Дегидратируйте образцы в серии этанола и используйте ксилол или метилсалицилат для просветления с последующим закреплением образцов на предметном стекле; добавьте каплю Canada Balsam и накройте покровным стеклом. Оставьте до высыхания на ночь. Для просветления мелких и средних нематод и encanto cephas поместите их в mounts of lact phenol на предметном стекле и накройте покровным стеклом на 15–30 минут. Для крупных нематод и encanto Cephas.
Поместите в 80% фенол на время до 60 минут. Осмотрите под световым микроскопом, чтобы убедиться, что мелкие структуры просветлены для изучения culex atos. Отрежьте его и поместите в определенный объем лактофенола.
На предметном стекле. Используйте покровное стекло, чтобы прижать кулекс для возможности измерения и подсчета звездчатых крючков rose. Отрежьте передний конец и зафиксируйте на Foss под микроскопом.
Поместите препарат под несколько капель лактофенола или в глицериновый железатый состав для постоянного препарата. Изучите органы рта с помощью светового микроскопа. После отсечения хвостов крупных нематод и их заключения в лактофенол, изучите морфологию вентральных паппилл и спикул самцов под световым микроскопом, используя методы, описанные в данном видео.
Обследование шлемов масочного землемола Sox было проведено в округе Миссула, штат Монтана, в период с 2007 по 2011 год. Всего было отловлено 56 землемолов с помощью ловчих ям, которые были исследованы в течение двух часов после смерти.
Общая распространенность инфекции составила 96%. Только две землеройки оказались свободны от паразитов. Было идентифицировано 15 видов гельминтов, включая девять видов цестод и шесть видов нематод. Один вид рода Esto, staphylo authorities, ранее не был описан.
Среди инфицированных органов были обнаружены тонкий кишечник, желудок, легкие и мочевой пузырь. Общая интенсивность заражения варьировалась от 7 до 234 особей гельминтов на инфицированном хозяине; видовое богатство или количество видов шлемовидных гельминтов на инфицированном хозяине варьировалось от 1 до 8 при среднем значении 4,1. После освоения эта методика может быть выполнена за 1–2 часа на мелком млекопитающем, например белке, и за 4–5 часов на более крупном млекопитающем, например еноте.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как собирать, сохранять и идентифицировать шлемы диких животных.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описан комплексный протокол сбора, консервации и идентификации гельминтов из диких позвоночных хозяев. Метод включает систематическое вскрытие, исследование органов, извлечение паразитов, консервацию и определение вида с использованием методов просветления и окрашивания. Данный протокол применим к широкому спектру позвоночных и позволяет точно оценить разнообразие гельминтов и интенсивность заражения в популяциях диких животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Паразитология
- Биология дикой природы
- Таксономия
Теоретическая часть
- Дикие животные часто подвержены паразитизму гельминтами, включая нематод, акантоцефалов, трематод и цестод.
- Точная идентификация гельминтов имеет важное значение для понимания взаимоотношений между хозяином и паразитом, а также экологии заболеваний.
- Сбор и идентификация гельминтов требуют применения специализированных методов препарирования органов, извлечения паразитов и морфологического анализа.
- Методы консервации и окрашивания критически важны для долгосрочного изучения и идентификации на видовом уровне.
Цель исследования
- Представить стандартизированный протокол сбора, консервации и идентификации гельминтов из диких животных.
- Продемонстрировать методы извлечения гельминтов из различных органов и их подготовки к морфологическому исследованию.
- Обеспечить точную видовую идентификацию с помощью процедур просветления и окрашивания.
Используемые методы
- Некропсия недавно погибших диких животных (в течение 4–6 часов после смерти).
- Систематическое препарирование и исследование всех основных органов с помощью стереомикроскопии.
- Промывание органов через сито с ячейками 106 μm для сбора гельминтов.
- Консервация гельминтов в этаноле, формалине или смеси спирта, формалина и уксусной кислоты в зависимости от типа паразита.
- Просветление (лактофенолом или фенолом) и окрашивание (гематоксилином по Харрису или кармином по Земишону) для морфологической идентификации.
- Заключение образцов на предметные стекла для детального изучения.
Основные результаты
- Данный протокол позволяет эффективно выделять и сохранять гельминтов из различных организмов хозяев-позвоночных.
- Идентификация видов облегчается за счет визуализации ключевых морфологических признаков после просветления и окрашивания.
- В тематическом исследовании землероек-масок (Sorex cinereus) в Монтане было выявлено, что 96% особей инфицированы; идентифицировано 15 видов гельминтов (9 цестод, 6 нематод), включая один ранее неописанный вид.
- Интенсивность инвазии варьировала от 7 до 234 особей на одного хозяина, при этом видовое богатство на одного хозяина составляло от 1 до 8 видов.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный и адаптируемый метод сбора и идентификации гельминтов в исследованиях дикой природы.
- Для его выполнения требуется базовое лабораторное оборудование и определенный опыт в области анатомии и распознавания паразитов.
- Идентификация на уровне вида в сложных случаях может потребовать консультации эксперта или молекулярного анализа.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Сбор и идентификация гельминтов из объектов дикой природы способствуют валидации мишеней в исследованиях в области паразитологии и инфекционных заболеваний, позволяя снизить риски за счет изучения механизмов взаимодействий между хозяином и патогеном. Данный метод обеспечивает прогностическую достоверность доклинических моделей путем характеристики паразитарной нагрузки и видового разнообразия у позвоночных хозяев. Он помогает в поиске трансляционных биомаркеров и разработке релевантных моделей заболеваний для идентификации перспективных противопаразитарных соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы о взаимодействии гельминтов и хозяев путем извлечения паразитов из конкретных органов.
- Практическая ценность: Способствует снижению биологических рисков путем подтверждения доступности мишени в условиях нативной ткани.
- Прогностическая ценность: Облегчает приоритизацию портфеля исследований путем количественной оценки распространенности и интенсивности инфекции у различных видов хозяев.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующей стандартизации анализа с использованием очищенных и окрашенных образцов.
- Практическая ценность: Обеспечение воспроизводимости за счет стандартизированных протоколов промывки органов, просеивания и микроскопического исследования.
- Масштабируемость: Возможность надежной оценки соединений путем количественного подсчета гельминтов на орган и на организм хозяина.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует моделированию систем, имеющих значение для изучения заболеваний, путем установления связи между идентификацией видов гельминтов и тропизмом к органам хозяина.
- Практическая ценность: обеспечивает согласование трансляционных биомаркеров посредством морфометрического анализа видоспецифических структур.
- Риск-ориентированное развитие: обеспечивает преемственность доклинических исследований путем документирования динамики инфекции на моделях позвоночных.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Этот метод интегрирован в континуум поиска новых лекарственных средств — от ранней валидации мишеней до доклинической валидации — путем получения количественных паразитологических данных для принятия решений о продолжении или прекращении дальнейших исследований.
- Открывательная биология: Обеспечивает проверку гипотез посредством патологоанатомического исследования органов и выделения паразитов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного просеивания через сито с ячейками 106 μm и использования стереомикроскопии для стабильного извлечения гельминтов.
- Аналитика: Позволяет проводить сравнительный анализ на основе зарегистрированных типов паразитов, их локализации в органах и показателей интенсивности на одного хозяина.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет идентификации видов, что помогает оценить релевантность модели.
- Корпоративное повторное использование: Служит универсальным методом, применимым для систем хозяев из классов млекопитающих, птиц, рептилий и амфибий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозов при валидации мишеней за счет идентификации гельминтов на уровне видов.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости посредством фиксированных рабочих процессов исследования и консервации органов.
- Стратегическая ценность: Улучшение принятия решений о целесообразности дальнейшего исследования (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности в исследованиях взаимодействия паразита и хозяина.
- Влияние на портфель проектов: Приоритизация с учетом рисков на основе количественных данных о видовом богатстве и интенсивности заражения гельминтами.
Особенности реализации
- Требуется опыт в проведении некропсии позвоночных и распознавании органов.
- Необходимы стерео- и световой микроскопы с возможностью просветления и окрашивания образцов.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами методов промывки, просеивания и консервации органов.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных таксонов хозяев и морфологий паразитов.
- Практическое ограничение: таксономическая идентификация до уровня вида требует много времени и может потребовать консультации экспертов или проведения ДНК-анализа.
