Характеристики микрогелей полиэтиленгликоля, образующихся в осадке, контролируются молекулярной массой реагентов

Общая цель данной процедуры заключается в формировании микрогелей из полиэтиленгликоля с помощью фотополимеризационной реакции осаждения для их последующего использования в качестве средств доставки лекарств и каркасов для тканевой инженерии. Это достигается путем предварительного приготовления реагентов, включая фотоинициатор, буферы, триэтиламин и раствор PEG DL, с их последующим нагревом до 37 °C. На втором этапе реагенты помещают в микроцентрифужную пробирку и перемешивают на вортексе при поддержании температуры 37 °C.

Затем добавляют сульфат натрия, перемешивают и подвергают раствор воздействию УФ-излучения в течение 30 секунд для сшивания. После сшивания на поверхности раствора образуется мутный слой, содержащий микрогели. На заключительном этапе в смесь добавляют PBS и центрифугируют до образования осадка.

В конечном итоге для измерения размера микрогелей используют микроскопию и динамическое рассеяние света, а плотность определяют с помощью градиента плотности декстрина. Кроме того, степень набухания рассчитывают путем измерения влажной и сухой массы микрогелей. Основным преимуществом данной методики по сравнению с другими методами, такими как эмульсионные, суспензионные и дисперсионные методы, является то, что микрогели, полученные в результате реакции осаждения, имеют низкий индекс полидисперсности без использования органических растворителей или стабилизаторов; мягкие условия реакции осаждения, возможность настройки свойств микрогелей и низкая вязкость для инъекций делают их подходящими для применений NVivo.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, такие как создание скаффолдов с однородным размером и низким индексом полидисперсности. Применение этой методики может быть распространено на терапию с доставкой лекарственных средств, поскольку факторы роста в препаратах могут быть легко инкапсулированы. Для начала отвесьте 500 milligrams фотоинициатора и добавьте его в 100 milliliters деионизированной воды для приготовления 0.5% раствора.

Защитите раствор от УФ-излучения и нагрейте его до 40 °C, постоянно перемешивая в течение примерно одного часа до полного растворения фотоинициатора. После полного растворения пропустите раствор через фильтр с порами 0,22 мкм для стерилизации и храните его при температуре 4 °C в темноте до использования. Затем предварительно нагрейте триэтиламин до 37 °C, чтобы снизить его вязкость.

Затем добавьте 612 µL этого раствора и 260 µL 6 M соляной кислоты к 39,4 mL PBS и стерильно доведите pH до 7,8. Профильтруйте полученный раствор через фильтр с порами 0,22 мкм и храните при 37 °C до использования. Следуя методике Sony et al., синтезируйте предшественники PEG в соответствии с опубликованными методами и храните готовый продукт при -20 °C в атмосфере аргона, затем непосредственно перед использованием приготовьте 1 mL 200 mg/mL раствора ПЭГ-диакрилата, медленно добавляя 0,8 mL PBS с добавлением триэтаноламина и соляной кислоты к 200 mg ПЭГ-диакрилата.

Также непосредственно перед началом эксперимента отвесьте 213 мг сульфата натрия и растворите его в 1 мл деионизированной воды. Для приготовления 1,5 М раствора нагревайте раствор при 37 °C в течение 20 минут, затем перемешивайте на вортексе до полного растворения. После растворения профильтруйте как конечный раствор сульфата натрия, так и раствор диакрилата ПЭГ при 37 °C через фильтры с порами 0,22 мкм.

Смешайте 127,5 µL PBS с триэтиламином и соляной кислотой, 10 µL 0,5% фотоинициатора и 25 µL раствора ПЭГ-диакрилата с концентрацией 200 mg/mL в микроцентрифужной пробирке объемом 1,6 mL. Затем добавьте любые молекулы, предназначенные для инкапсуляции.

Нагрейте эти пробирки вместе с 1,5 molar раствором сульфата натрия до 37 °C. Затем добавьте 87,5 µL предварительно нагретого 1,5 molar раствора сульфата натрия в первую пробирку с раствором ПЭГ и перемешайте содержимое, три-пять раз пропипетировав раствор. После перемешивания концентрация соли распределится равномерно, и раствор должен стать прозрачным.

Поместите пробирку под УФ-излучатель и проведите сшивку в течение 30 секунд. После сшивки на поверхности раствора, содержащего микрогели, должен образоваться мутный слой. Затем добавьте в пробирку 750 µL PBS и тщательно перемешайте раствор с помощью вортекса.

Затем центрифугируйте смесь при 4,000 ×g в течение двух минут до образования осадка. После центрифугирования аккуратно удалите супернатант, стараясь не потревожить осадок, и суспендируйте микрогели в свежем PBS. Промойте микрогели свежим PBS в общей сложности пять раз, центрифугируя их после каждой промывки.

После финальной промывки удалите супернатант и перенесите 30 µL микрогелей из осадка в 1 мл деионизированной воды. Затем подвергните раствор микрогелей воздействию ультразвука в ультразвуковой ванне в течение одного часа при частоте 50–60 Гц и силе тока 1,4 А. Далее нанесите 15 µL раствора микрогелей на чистый предметное стекло с кислотным травлением и накройте его покровным стеклом с кислотным травлением № 1,5.

Переверните предметное стекло на лабораторную салфетку и аккуратно нажмите на него, чтобы удалить излишки раствора и убедиться, что микрогели расположены в один слой. Затем с помощью оптического микроскопа сделайте несколько снимков микрогелей, используя иммерсионный объектив 100x с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC). Измерьте микрогели для определения репрезентативного значения диаметра.

Рассчитайте индекс полидисперсности с помощью приведенного здесь уравнения на основе объема, в котором N — общее количество микрогелей, а VI — объем микрогеля. Для измерения средней плотности микрогелей сначала приготовьте растворы декстрина с концентрацией 7, 6, 5, 4, 3 и 1% в деионизированной воде; плотности растворов декстрина приведены здесь. Затем добавьте два миллилитра 7% раствора декстрина в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем медленно внесите пипеткой 2 mL 6% раствора декстрина, чтобы сформировать четкий слой поверх 7% раствора декстрина. Через пять минут добавьте 2 mL следующего слоя, состоящего из 5% раствора декстрина, и продолжайте в таком же порядке, пока все концентрации декстрина не будут нанесены слоями в порядке убывания их концентрации. Затем аккуратно нанесите микрогели поверх 1% раствора декстрина и центрифугируйте градиент при температуре 5 °C с ускорением 4 000 ×g в течение 10 минут.

Затем визуализируйте расположение микрогелей и рассчитайте их плотность в зависимости от их положения между слоями. Для измерения набухшей массы микрогелей сначала взвесьте пустую микроцентрифужную пробирку, а затем добавьте в неё один миллилитр микрогелей. Пять раз промойте микрогели деионизированной водой, меняя её после каждой промывки.

Центрифугируйте образец в течение 10 минут при 4 000 ×g, чтобы осадить микрогели после последнего промывания. Ресуспендируйте их в деионизированной воде и оставьте для набухания минимум на 48 часов. Через 48 часов центрифугируйте набухшие микрогели в течение 10 минут при 4 000 ×g, затем удалите весь супернатант.

Затем взвесьте образец и зафиксируйте его влажную массу. После получения точного значения влажного веса заморозьте микрогели при температуре -80 °C, затем подвергните их лиофилизации для удаления воды и определения сухой массы. Когда вся вода сублимируется, рассчитайте содержание воды и полимера в микрогелях, используя приведенные здесь уравнения, где MS — влажный вес микрогелей, а MD — сухой вес.

Здесь показан средний диаметр микрогелей ПЭГ, сформированных с использованием 20% ПЭГ различной молекулярной массы. Увеличение времени УФ-облучения также повлияло на диаметр микрогелей. С увеличением времени УФ-облучения увеличивался диаметр всех трех представленных составов.

Плотность, измеренная с помощью декстриновых градиентов, снижалась с увеличением молекулярной массы молекул ПЭГ-прекурсора. Это также подтверждается на графике содержания воды, согласно которому ПЭГ с более высокой молекулярной массой содержал большее количество воды на грамм полимера. Наконец, чтобы продемонстрировать возможность загрузки микрогелей флуоресцентно конъюгированным белком, в смесь перед полимеризацией был добавлен альбумин, который оказался заперт внутри сфер.

Повышение концентрации флуоресцентно меченого белка приводило к увеличению индекса полидисперсности сфер, однако их средний размер оставался постоянным. При выполнении данной процедуры важно не забывать нагревать все растворы до 37 °C, а также тщательно перемешивать микрогели на вортексе для разрушения возможных агрегатов во время промывки и подготовки предметных стекол для визуализации. После выполнения этой процедуры можно применить дополнительные методы инкапсуляции лекарственных средств, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся эффекта высвобождения препарата.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как создавать микрогели из PEG-DA в мягких условиях с помощью реакций осаждения.