Мониторинг изменения мембранного полярность, мембраны целостности и внутриклеточных концентрации ионов в Пневмококк Использование флуоресцентных красителей

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании флуоресцентных красителей для мониторинга изменений в динамике мембран и концентрации внутриклеточных ионов в бактериальной системе. Это достигается путем инкубации бактерий во время фазы их роста с интересующим флуором до тех пор, пока он не уравновесится на их мембранах. Затем бактерии обрабатываются средством выбора и контролируются их флуоресценция.

Результаты могут показать изменения деполяризации мембраны, целостности мембраны и концентрации внутриклеточных ионов на основе наблюдаемых изменений флуоресценции индикаторных красителей. Основное преимущество этого метода по сравнению с традиционными методами электрофизиологии, такими как зажим пластыря, который используется в эукариотических системах, заключается в том, что изменения в динамике мембраны и внутриклеточные концентрации ионов теперь можно отслеживать у бактерий с помощью флуоресценции. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что для оптимизации концентрации красителя требуются некоторые усилия.

Условия загрузки и настройки обнаружения Начните с бактериальных клеток. Только что рассыпанные в промывном растворе предварительно суспендируют гранулу не менее чем в одном миллилитре PBS на 100 миллионов КОЕ на миллилитр, чего достаточно для пяти образцов. Перелейте один миллилитр промытых клеток в микроцентрифужную пробирку и добавьте 25 микролитров одного молярного фильтра.

Стерилизованный исходный раствор глюкозы затем инкубируют клетки в нагревательном блоке при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Добавленная глюкоза может варьироваться в зависимости от эксперимента. Через 15 минут добавьте пять микролитров 50 микромолярного отмирания и 10 микролитров раствора PI.

Тщательно перемешайте клетки, пипетируя их вверх и вниз несколько раз. Затем разделите эту клеточную суспензию на пять лунок для образцов прозрачной 96-луночной пластины. Загрузите пластину в предварительно нагретый считыватель пластин для обнаружения затухающих NP

Теперь контролируйте равновесие отмирания на клеточных мембранах, проводя измерения один раз в минуту в течение 30–40 минут, пока показания не стабилизируются до значения до обработки. Затем извлеките пластину и добавьте выбранное экспериментальное вещество. Немедленно верните пластину в считыватель и продолжайте контролировать затухание и PI-флуоресценцию в течение желаемого периода времени.

При подготовке загрузочного буфера для этой процедуры обязательно кратковременно проведите его в вихре перед добавлением PBS и Probenecid. После добавления этих растворов снова перемешайте его и заверните в фольгу до одного миллилитра суспензии с двумя x ячейками. Добавьте один миллилитр из двух х загрузочный буфер.

Этого достаточно для 10 образцов. Инкубируйте смесь на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 75 минут, защищенной от света На протяжении всех этих анализов. Может потребоваться корректировка концентрации красителя и времени инкубации для оптимизации анализа и базового уровня обнаружения флуоресценции, в зависимости от конкретных видов бактерий и других переменных экспериментальной системы.

После инкубации промойте клетки трижды для каждой промывки. Гранулируйте клетки при 2400 G в течение 10 минут и повторно суспендируйте их в двух миллилитрах PBS, содержащих один x прон. После трех промывок инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще 30 минут.

Это позволяет эстро внутри бактерий гидролизовать эфирные группы красителя, делая краситель активным внутри клетки. Далее из клеток удаляют снат и суспензируют их в двух миллилитрах PBS, содержащих один х пробенецид. При необходимости глюкоза теперь может быть добавлена обратно, чтобы зарядить бактерии энергией: загрузите 200 микролитров клеток в одну лунку 96-луночной пластины для каждого образца и загрузите пластину в предварительно подогретый считыватель в одном образце.

Ну, сначала установите базовое показание на правильных длинах волн и со скоростью одно показание в секунду в течение одной минуты. Затем снимите пластину и добавьте около пяти микролитров выбранного вами лечения. К этому.

Ну и быстро пипеткой вверх и вниз несколько раз смешать с лечением и сразу же вернуть пластину в считыватель. Продолжайте делать замеры в течение нужного времени. Чтобы проанализировать данные, вычислите отношение значений флуоресценции для каждой точки времени, разделив значение, единицу на два, и отобразите значения отношения на графике.

При подготовке создайте диапазон из пяти или шести буферов с высоким содержанием калия со значениями pH от 6,5 до 8,0. Как и в предыдущей процедуре, используйте вихрь для подготовки двух загрузочных буферов из промывки культуры в середине логарифмической фазы и сконцентрируйте клетки. Затем замените SNAT двумя миллилитрами BS Чтобы сделать четырехклеточную суспензию.

Смешайте один миллилитр из четырех суспензий x cell с одним миллилитром из двух x загрузочного буфера. Теперь инкубируйте клетки на водяной бане при температуре 30 градусов Цельсия в течение 40 минут. Бейте его от света.

Теперь промываем клетки три раза. Гранулируйте ячейки, как показано ранее. Добавьте обратно четыре миллилитра PBS, содержащего два x prop Benin, и один миллимоляр глюкозы и повторите центрифугирование после трех стирок.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия еще пять минут. Чтобы определить фон флуоресцентного фильтра, простерилизуйте около 500 микролитров взбудораженной бактериальной суспензии для удаления бактерий. Затем перелейте 200 микролитров фильтрата в планшет на 96 лунок и измеряйте абсорбцию из этой лунки в течение минуты.

Чтобы получить калибровочную кривую in vivo, уменьшите 500 микролитров ALI ватт нагруженных и заряженных элементов и реактивных систем. Суспендируйте их в ряде высококалийных буферов разного рН к каждому образцу, добавьте 20 микромоляров ризина. Это уравновешивает внутриклеточный pH клеток к pH окружающего буфера.

Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации перенесите образцы на планшет 96 Well в считывателе планшетов. Измерьте флуоресценцию каждого образца в течение нескольких минут, чтобы установить показания исследования для каждого из них. Колодец.

Чтобы проанализировать эти данные, вычтите фоновые значения флуоресценции, а затем вычислите отношение значений флуоресценции путем деления. Единица по значению два, построите значения отношения для каждого буфера pH, чтобы создать калибровочную кривую для измерения изменений внутриклеточного pH. Загрузите 200 микролитров образцов заряженных клеток в планшет и измеряйте флуоресценцию каждые пять секунд в течение пяти минут.

Одновременно добавьте 10 микромолярных CCCP к одному образцу, одновременно добавляя интересующие агенты к другим образцам. CCCP представляет собой выровненный по времени положительный контроль для снижения внутриклеточного pH. Немедленно верните пластину в считыватель и продолжайте измерять флуоресценцию каждые пять секунд в течение 10 минут.

В качестве дополнительного контроля добавьте 20 микромоляров NI гарнизона во все образцы, чтобы уравновесить pH бактерий до pH буфера еще на пять минут. При исследовании полярности мембраны бактерии необходимо инкубировать с отмиранием в течение примерно 40 минут, чтобы позволить красителю уравновеситься на мембране. На это указывает устойчивое снижение флуоресценции, которое выравнивается.

PI не требует уравновешивания, но наряду с затуханием он полезен для мониторинга разрыва мембраны. Одновременно с полярностью, деполяризацией и разрывом бактерий свидетельствует повышение интенсивности флуоресценции обоих красителей в течение менее 2:00 АМ, рассчитывается соотношение двух флуоресцентных сигналов, и увеличение или уменьшение этого соотношения соответствует внутриклеточному кальцию. Для PBFI am внутриклеточный калий измеряется с помощью коэффициентов флуоресценции.

Внутриклеточный водород измеряется с помощью соотношений флуоресценции B-C-E-C-F am. При добавлении йоно-четырех ионов мицина кальция кальций поступает в клетку, вызывая увеличение коэффициента флуоресценции. Добавление вальми имеет обратный эффект, вызывающий вытекание калия из клетки, на что указывает снижение коэффициента флуоресценции.

B-C-E-C-F позволяет измерять внутриклеточный рН, сначала делаются калибровочные кривые в различных буферах с известным рН. Уменьшение коэффициента флуоресценции красителя соответствует снижению pH. Это видно по добавлению протона силы CCCP, черной линии, а после добавления протонного рассеивателя движущей силы — синей линии.

Вторая стрелка показывает добавление ниссина, который уравновешивает внутриклеточные и внеклеточные концентрации водорода. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить деполяризацию мембраны, целостность мембраны и внутриклеточную концентрацию ионов в бактериальных клетках. Вы также должны быть в состоянии использовать этот протокол в качестве отправной точки для изучения других свойств и бактериальных клеток.