Инженерные основе фибрина тканей Конструкции из Миофибробласты и применение ограничений и напрягаться, чтобы индуцировать клеточную и коллагена (Re) организации

Общая цель этой процедуры заключается в создании конструкций на основе фибрина, которые могут быть использованы для изучения реорганизации клеток и коллагена. Это достигается путем выделения венозных подкожных клеток человека из донорской ткани и их наращивания в культуре. Второй шаг – наклеивание полосок Velcro на гибкие мембраны.

На дне шести колодцев нужно создать квадратное пространство в центре, в котором будет удерживаться конструкция. Затем смесь фибриногенных тромбиновых клеток и флуоресцентно меченых бусин добавляется в пространство между полосками Velcro и полимеризуется с образованием геля. Последним шагом является кондиционирование клеток и индуцирование формирования ориентированного матрикса путем приложения либо одноосной циклической деформации к конструкции, либо путем высвобождения статической деформации.

Обрезая фибриновый гель со стоек Velcro в одном направлении. В конечном счете, можно получить результаты, описывающие изменения в клеточной и коллагеновой реорганизации путем мониторинга конструкций с течением времени с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ремоделирования коллагена, связанные со скоростью образования коллагена и его переориентацией различными типами клеток.

Для начала приобретите человеческую донорскую ткань из венозной saana magna в соответствии с рекомендациями по вторичному использованию материала. Затем изолируйте человеческие венозные подкожные клетки или H VSC из ткани, следуя протоколу Schnell et al., и храните их в жидком азоте. При необходимости расширяйте ячейки, поместив один флакон, содержащий 250 000 быстро размораживаемых H VSC, в колбу T 75 с 15 миллилитрами предварительного подогрева.

Среда состоит из 440 миллилитров усовершенствованного DMEM и 50 миллилитров фетальной бычьей сыворотки. Пять миллилитров 100 X pen strep и пять миллилитров 200 мл. Меняйте питательную среду каждые два-три дня в течение примерно двух недель, пока клетки не сливаются.

После слияния соберите и разделите клетки до прохода. Девять. Используют трипсин до тех пор, пока не будет достаточного количества клеток для запланированного эксперимента. Для каждой конструкции требуется примерно 1,5 миллиона ячеек.

Когда будет выращено достаточное количество клеток, соберите их с точностью 90%, а затем суспендируйте клетки в питательных средах при концентрации 15 миллионов клеток на миллилитр. Положите их на лед до тех пор, пока они не понадобятся. Приготовьте силиконовый клей, смешав эластомер и отвердитель в соотношении 10 к одному.

С помощью этого клея прикрепите полоски размером семь на три миллиметра, захваченные с мягкой стороны Velcro, к гибкой мембране гибких ячеистых пластин. Чтобы сформировать крестообразную форму с открытым центром, просушите силиконовый клей в течение ночи в духовке при температуре 60 градусов Цельсия, чтобы обеспечить затвердевание клея. Затем простерилизуйте пластину, добавив в каждую лунку по пять миллилитров 70%-ного этанола и выдержав в течение 30 минут при комнатной температуре.

Трижды промойте лунки стерильным ПБС. Затем удалите PBS из лунок и полоски Velcro. Поместите незакрытую пластину под ультрафиолетовую лампу вытяжки для культуры тканей на 30 минут для стерилизации поверхностей.

Когда закончите, накройте тарелку крышкой и держите ее стерильной до использования. Затем приготовьте тканевую инженерную среду, добавив 130 мг аллиевой кислоты, два фосфата к 500 мл питательной среды в течение первых семи дней культивирования. Кроме того, добавьте один миллиграмм на миллилитр эпсилон-аминокапроновой кислоты, чтобы предотвратить разложение фибрина, растворите фибриноген до концентрации 10 мг фактического белка на миллилитр тканевой инженерной среды, дополненной аминокапроновой кислотой, аккуратно перемешав.

Затем стерильные. Отфильтруйте раствор фибриногена через шприцевой фильтр 0,22 микрона и храните его на льду до использования. Далее приготовьте раствор тромбина, разбавив исходный тромбин до конечной концентрации 10 международных единиц на миллилитр в среде тканевой инженерии с добавлением аминокапроновой кислоты и храните его на льду до использования.

Далее следует 100 микролитров приготовленной ранее клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку для каждой тканевой конструкции, которая будет изготовлена. Центрифугируйте клетки при 350-кратном G в течение семи минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 50 микролитрах раствора тромбина и добавьте четыре микролитра, синие флуоресцентные полистирольные микросферы, которые будут использоваться в качестве внутренних референсных маркеров. Далее наберите 50 микролитров раствора фибриногена в наконечник пипетки.

Увеличьте объем пипетки до 100 микролитров, а затем нанесите 50 микролитров раствора фибриногена в центрифужную пробирку. С помощью смеси тромбина и клеток аккуратно смешайте тромбин и фибриноген, набрав смесь объемом 100 микролитров, чтобы предотвратить образование пузырьков. После того, как раствор будет тщательно перемешан, впрыскивание гелевой смеси пипеткой в полоски Velcro и между ними, мы быстро, так как типичное гелианское время для фибриновых гелей составляет порядка 20 секунд, инкубируйте конструкции в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном буферном инкубаторе с 5% углекислым газом, чтобы позволить им загустеть.

Затем добавьте в каждую лунку по шесть миллилитров тканевой инженерной среды с аминокапроновой кислотой и поместите пластину обратно в инкубатор. Заменяйте носитель каждые два-три дня в течение первых семи дней. Через неделю удалите добавку аминокапроновой кислоты из среды и продолжайте культивирование гелей с помощью среды тканевой инженерии.

По-прежнему обменивая его каждые два-три дня в течение первых пяти дней в культуре, позволяет конструкциям уплотняться и реорганизовываться под статическим напряжением, образуя коллагеновые волокна, биаксиально из-за ограничений волокон, чтобы индуцировать реорганизацию коллагена в одном направлении в статических условиях. Во-первых, культивируйте клетки в течение еще одной недели на 12-й день, разрежьте тканевую конструкцию из двух полосок Velcro в одном направлении. Это вызовет напряжение в обратном направлении, так как фибрин уплотняется.

В качестве альтернативы, для циклической загрузки, поместите плиты поверх набора загрузочных стоек в гибкую опорную плиту, оснащенную прокладкой на шестой день, загрузочные стойки будут поддерживать гибкую мембрану колодцев и позволят опускать основание стоек вниз для создания напряжения в одном направлении. Затем настройте программный протокол для приложения циклической деформации к конструкции. Показанная здесь программа предназначена для прерывистой деформации, напоминающей синусоиду, при которой конструкт напрягается от нуля до 5% при частоте в один герц в течение трех часов, чередуясь с тремя часами отдыха.

Когда программа подготовлена, включите вакуумный насос и запустите программу. Контроллер будет регулировать прочность вакуума в системе, которая тянет вниз мембраны вокруг опорных столбов для приложения циклической деформации к конструкциям в соответствии с программой. Выполняйте программу в течение одной недели, заботясь о том, чтобы менять среду каждые два-три дня после одной недели кондиционирования, вызвать реорганизацию коллагена, поворачивая прямоугольную стойку на 90 градусов, чтобы изменить направление напряжения в течение трех дней.

Чтобы визуализировать активное ремоделирование коллагена в реальном времени, добавьте оранжевый цвет клеточного трекера. Добавьте концентрацию четырех микромоляров для окрашивания цитоплазмы и CNA 35 OG 4 88. Добавьте концентрацию одного микромоляра, чтобы визуализировать коллагеновые волокна.

Эти зонды не будут мешать жизнеспособности клеток или образованию коллагена. Затем инкубируйте клетки в течение одного часа в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации извлеките культуральную пластину из инкубатора и транспортируйте ее к конфокальному лазерному сканирующему микроскопу для визуализации клеток и коллагена.

Сделайте снимки гелей на поверхности и на глубине примерно до 60 микрон в каркасе, чтобы увидеть изменения в организации на этих уровнях с течением времени. Затем верните планшет в состояние механического кондиционирования внутри инкубатора. Повторяйте эту процедуру каждые несколько дней, чтобы отслеживать прогресс клеточной реорганизации в ответ на раздражители.

Флуоресцентные микросферы, добавленные в смесь фибриногена до полимеризации, захватываются фибриновой сетью и хорошо работают в качестве референсных маркеров, обеспечивая визуализацию одной и той же области в разные моменты времени при культивировании в статических условиях, и прикрепляются ко всем четырем столбам. Через три дня после обрезки двух оптоволоконных стоек не видно никакой реальной ориентации волокна или сотовой связи. Одноосевая деформация, вызванная сокращением, выровняла коллагеновые волокна, показанные зеленым цветом.

Венозные подкожные клетки человека, которые циклически деформировались в одном направлении в течение одной недели, показаны здесь на поверхности конструкции и на глубине 60 микрон в геле. Когда направление деформации было повернуто на 90 градусов, было обнаружено, что клеточная реакция через три дня была более быстрой на поверхности, чем в ядре ткани. После освоения инженерии эти тканевые конструкции на основе FI могут быть выполнены примерно за два часа.