Оптимизированный протокол для цельной подготовки сетчатки к визуализации и иммуногистохимии

В этой процедуре используется ткань сетчатки мыши, чтобы продемонстрировать, как стабилизировать нежную нервную ткань для сохранения структурной целостности. Во время нескольких этапов иммуногистохимического окрашивания сначала происходит зарождение ядра глаза, удаляется роговица и отделяется сетчатка от склеры. Сделайте надрезы на наглазнике сетчатки, чтобы разгладить ткань.

Затем прикрепите сетчатку к кольцевой усиленной мембране с помощью аспирационного переноса без прямых манипуляций для сохранения целостности ткани. Теперь переложите кольцо в многолуночную пластину для окрашивания. Наши результаты показывают, что этот метод может быть эффективно использован в живых тканях и обеспечивает превосходный субстрат для визуализации синаптических белков по сравнению с существующими металлами для обработки рассеченной сетчатки.

Эти методы позволяют пересаживать нежную ткань с минимальными физическими манипуляциями. Это снизит вероятность искажения и повреждения. Впервые нам пришла в голову эта идея, когда нам понадобилось записать из плоской ткани у мыши RD one, модель дегенерации сетчатки, и эта сетчатка мыши чрезвычайно тонкая и хрупкая из-за обширной потери клеток, вызванной мутацией Chief.

Постдок в нашей лаборатории присоединится ко мне для демонстрации процедуры. Во-первых, зародыши глаз мыши, находящейся под наркозом, и перенос глаз в насыщенный кислородом буферный раствор Ringer. Чтобы удалить роговицу, зажмите глаз в лимбе щипцами, а затем разрежьте круговую дорожку вдоль ora serrata.

Вытащите линзу с помощью щипцов для болюсных инъекций и электрофизиологической записи. Используйте щипцы со смешанными краями, чтобы удалить как можно больше стекловидного тела. Теперь стабилизируйте наглазник, крепко удерживая склеру щипцами.

Поместите второй набор щипцов между сетчаткой и наглазником. Медленно перемещайте щипцы по окружности. Разрежьте зрительный нерв между сетчаткой и наглазником и снимите наглазник ножницами.

Делайте разрезы от периферии сетчатки вплоть до зрительного нерва. В качестве альтернативы, чтобы задействовать всю сетчатку, сделайте разрезы от периферии на полпути к зрительному нерву, чтобы укоротить держатель. Удалите лишнюю часть с помощью токарного станка.

Затем отполируйте шероховатые поверхности мелкой наждачной бумагой. Уберите ножки из-под кольца. Отрежьте узкий кончик пластиковой пипетки.

Затем перенесите ткань с небольшим раствором на оболочку. Постепенно удаляйте раствор, одновременно растягивая сетчатку и разворачивая ткани. Теперь приложите сетчатку к мембране ганглиозными клетками вверх.

Отрежьте удерживающий кончик миллилитрового шприца и поместите его непосредственно под ткань. Потяните поршень назад до объема около 0,3 миллилитров, чтобы физически закрепить ткань внутри мембраны. Вытащите несколько боросиликатных капиллярных пипеток с сопротивлением примерно в один мега.

Затем аккуратно разломайте кончик каждой патч-пипетки. Далее добавьте 0,3 микролитра селектина стокового раствора морилки в 10 микролитров буферизованного раствора Рингера. Теперь поместите мембрану в записывающую камеру, перфузированную теплыми насыщенными кислородом кучами буферным раствором звонка.

Расположите пипетку, содержащую краситель, напротив внутренней пограничной мембраны с помощью микрометрового манипулятора. Далее продвигайте пипетку, чтобы проникнуть во внутреннюю пограничную мембрану. Затем введите раствор для окрашивания в одно или несколько целевых мест.

Теперь подождите 10 минут, чтобы ткань восстановилась после инъекции, рассматривая ее под эпифлуоресцентным освещением. При желании перенесите вкладыш на стеклянную чашку для культуры снизу, расположив ее сетчаткой вниз. Добавьте одну каплю раствора с горкой, чтобы образец оставался влажным.

Кроме того, поместите три пятна вакуумной смазки по периметру пластикового кольца, чтобы надежно закрепить вкладыш на чашке для культуры. После фиксации переведите чашку в предметный столик микроскопа, погрузите мембрану в растворы градиента сахарозы. Вырежьте мембрану из пластикового кольца-вставки.

Удалите как можно больше раствора с помощью салфеток Kim и положите его на параметр сетчаткой вверх. Перенесите параформу с тканью в криостатную камеру и добавьте каплю ОКТ-среды. Используйте устройство быстрой заморозки для ускорения заморозки.

Отсоедините замороженный образец и переверните его. Теперь отрежьте лишнюю замороженную ОКТ. Оставьте примерно два миллиметра вокруг образца с трех сторон и миллиметров от стороны, которая будет крепиться к держателю.

Нанесите каплю ОКТ на открытую сторону сетчатки, оставив прикрепленную область свободной. Заморозьте мембрану, содержащую ткань сетчатки. Поместите каплю ОКТ на кольцо держателя холода.

Сразу же вставьте замороженный образец в каплю. Вырежьте срезы размером от 10 до 20 микрон при температуре минус 19 градусов Цельсия и расположите их на теплых предметных стеклах для адгезии полилизина. Поместите горки с прикрепленными секциями на нагревательную платформу с температурой 41 градус Цельсия на две-три минуты в темноте.

Затем храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Этот эксперимент иллюстрирует быструю и простую характеристику сосудистой сети сетчатки как сложной сети кровеносных сосудов, которые охватывают несколько слоев сетчатки. Комбинируя болюсную загрузку изоселектина с мечением сульфаниларианским рубцом, живую ткань можно визуализировать и сканировать почти сразу в сетчатке, кровеносные сосуды могут быть помечены от поверхностного до глубокого слоя.

В отличие от относительно хорошо диффузионного, селектина СРГ плохо проникает через внутреннюю пограничную мембрану. Существует несколько преимуществ фиксации карбимидом по сравнению с обычной фиксацией параформальдегидом при мечении синаптических белков, например, после короткого периода фиксации карбимидным иммунофлуоресцентным окрашиванием для синаптического маркера. PSD 95 в IPL имел яркий точечный вид, согласующийся с различием отдельных синапсов.

Напротив, при использовании обычного фиксатора параформы альдегида идентификация синаптических компонентов менее ясна. Аналогичные результаты были получены и на срезах криостата сетчатки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как правильно монтировать нежную ткань на эту мембрану и как наносить цитохимическое окрашивание на препарат одним мастером.

Чтобы прикрепить сетчатку к фильтру, вам потребуется 15 минут.