Оптимизированный протокол для цельной подготовки сетчатки к визуализации и иммуногистохимии

В данной процедуре используется ткань сетчатки мыши для демонстрации способов стабилизации хрупкой нервной ткани с целью сохранения ее структурной целостности. В ходе нескольких этапов иммуногистохимического окрашивания необходимо провести энуклеацию глаза, удалить роговицу и отделить сетчатку от склеры. Выполните надрезы чашки глаза с сетчаткой, чтобы расправить ткань.

Затем закрепите сетчатку на мембране с кольцевым усилением с помощью вакуумного переноса без прямого манипулирования, чтобы сохранить целостность ткани. Теперь перенесите кольцо в многолуночный планшет для окрашивания. Наши результаты показывают, что этот метод может быть эффективно использован на живой ткани и обеспечивает более подходящий субстрат для визуализации синаптических белков по сравнению с существующими методами работы с препарированной сетчаткой.

Эти методы позволяют переносить деликатные ткани с минимальным физическим воздействием. Это снижает вероятность деформации и повреждения. Впервые эта идея возникла при необходимости проведения записей с плоского препарата ткани мыши линии RD1 — модели ретинальной дегенерации, сетчатка которой чрезвычайно тонка и хрупка из-за массовой гибели клеток, вызванной мутацией Chief.

Постдок из нашей лаборатории поможет мне в демонстрации данной процедуры. Сначала энуклеируйте глаза анестезированной мыши и перенесите их в оксигенированный раствор Рингера-Хепса. Чтобы удалить роговицу, зафиксируйте глаз в области лимба с помощью пинцета, а затем сделайте круговой разрез вдоль ora serrata.

Извлеките хрусталик с помощью пинцета для проведения болюсных инъекций и электрофизиологических записей. Используйте пинцет с закругленными краями, чтобы удалить максимально возможный объем стекловидного тела. Теперь стабилизируйте глазную чашу, плотно зафиксировав склеру пинцетом.

Расположите второй пинцет между сетчаткой и глазной чашечкой. Медленно перемещайте пинцет по окружности. Перережьте зрительный нерв между сетчаткой и глазной чашечкой и удалите глазную чашечку с помощью ножниц.

Выполните разрезы от периферии сетчатки до самого зрительного нерва. В качестве альтернативы, чтобы использовать сетчатку целиком, сделайте разрезы от периферии до середины пути к зрительному нерву, чтобы укоротить держатель. Удалите излишки с помощью токарного станка.

Затем зашлифуйте шероховатые поверхности мелкой наждачной бумагой. Снимите ножки из-под кольца. Отрежьте узкий кончик пластиковой пипетки.

Затем перенесите ткань вместе с небольшим количеством раствора на мембрану. Постепенно удаляйте раствор, расправляя сетчатку и разворачивая ткань. Теперь закрепите сетчатку на мембране так, чтобы ганглионарные клетки были обращены вверх.

Отрежьте удерживающий кончик шприца объемом 1 мл и расположите его непосредственно под тканью. Оттяните поршень до объема примерно 0,3 мл, чтобы физически зафиксировать ткань внутри мембраны. Вытяните несколько боросиликатных капиллярных пипеток, используя сопротивление примерно 1 МОм.

Затем аккуратно отломите кончик каждой патч-пипетки. Далее добавьте 0,3 µL стокового раствора красителя для селектинов к 10 µL раствора Хэпса-Рингера. Теперь поместите мембрану в регистрирующую камеру, перфузируемую теплым оксигенированным раствором Хэпса-Рингера.

С помощью микроманипулятора подведите пипетку с красителем к внутренней пограничной мембране. Продолжайте продвигать пипетку до прокола внутренней пограничной мембраны. Затем введите окрашивающий раствор в одну или несколько целевых точек.

Теперь дайте ткани восстановиться после инъекции в течение 10 минут, наблюдая за ней при эпифлуоресцентном освещении. При необходимости перенесите вставку в культуральную чашку с стеклянным дном, поместив ее сетчаткой вниз. Добавьте одну каплю раствора HEPES, чтобы образец оставался увлажненным.

Также нанесите три капли вакуумной смазки по периметру пластикового кольца, чтобы надежно зафиксировать вставку в чашке для культивирования. После фиксации перенесите чашку на предметный столик микроскопа и погрузите мембрану в растворы сахарозного градиента. Извлеките мембрану из пластикового кольца-вставки.

Максимально удалите раствор с помощью салфеток Kim wipes и поместите образец на парафильм так, чтобы сетчатка была обращена вверх. Перенесите парафильм с тканью в камеру криостата и добавьте каплю среды OCT. Используйте устройство для быстрого замораживания, чтобы ускорить процесс.

Отделите замороженный образец и переверните его. Теперь срежьте излишки замороженного состава OCT. Оставьте примерно два миллиметра вокруг образца с трех сторон и один миллиметр со стороны, которая будет прикреплена к держателю.

Покройте открытую сторону сетчатки каплей OCT, оставив прикрепленный участок свободным. Заморозьте мембрану, содержащую ткань сетчатки. Нанесите каплю OCT на охлажденное кольцо-держатель.

Немедленно поместите замороженный образец в криостат. Сделайте срезы толщиной 10–20 мкм при температуре -19 °C и перенесите их на теплые предметные стекла с полилизиновым покрытием. Поместите стекла с закрепленными срезами на нагревательную платформу при температуре 41 °C на две-три минуты в темноте.

Затем храните образцы при температуре -20 °C. Этот эксперимент демонстрирует быстрый и простой способ характеристики сосудистой сети сетчатки как сложной системы кровеносных сосудов, пронизывающих несколько слоев сетчатки. Благодаря сочетанию болюсного введения изо-селектина с иммерсионным мечением сульфаруминином можно практически мгновенно визуализировать и сканировать живую ткань сетчатки, при этом кровеносные сосуды метятся от поверхностного до глубокого слоя.

В отличие от относительно хорошо диффундирующего селектина, SRH плохо проникает через внутреннюю пограничную мембрану. При мечении синаптических белков фиксация карбимидом имеет несколько преимуществ перед традиционной фиксацией параформальдегидом; например, после короткого периода фиксации карбимидом иммунофлуоресцентное окрашивание на синаптический маркер PSD 95 в IPL имело яркий пунктирный вид, что позволяло различать отдельные синапсы.

Напротив, при использовании обычного параформальдегидного фиксатора идентификация синаптических компонентов выражена менее четко. Аналогичные результаты были получены в криостатных срезах сетчатки. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как закреплять хрупкую ткань на этой мембране и как проводить цитохимическое окрашивание препарата.

Закрепление сетчатки на фильтре займет у вас 15 минут.