Генерация сдвига адгезии карте с помощью SynVivo Синтетический микрососудистых сетей

Общая цель следующего эксперимента заключается в получении карты адгезии клеточных частиц при сдвиге в ходе одного эксперимента с использованием синтетических микрососудистых сетей. Это достигается путем предварительного покрытия микрофлюидного устройства интересующим белком, в данном случае — авидоном. На втором этапе в устройство при физиологических скоростях сдвига вводятся биотинилированные частицы, которые связываются с покрытым авидоном устройством, образуя различные паттерны в зависимости от локальной скорости сдвига.

Затем подсчитывают количество связанных частиц для построения карты сдвиговой адгезии частиц с использованием созданной вычислительным путем базы данных значений скорости сдвига в сети. Результаты показывают, что карту сдвиговой адгезии можно получить в ходе одного эксперимента, что обеспечивает значительную экономию времени и реагентов по сравнению с традиционными камерами с параллельными пластинами. Основным преимуществом данной технологии перед существующими методами, такими как линейные проточные каналы, является возможность построения карт сдвига на основе одного эксперимента, что приводит к существенному сокращению затрат и времени.

Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области доставки лекарств, таких как способность средств доставки связываться с искомыми мишенями. Идея этого метода возникла у нас при использовании проточных камер с лопастными пластинами для изучения повреждений конкретных клеток. Несмотря на условия потока жидкости, основной целью данного анализа является получение базовых данных об адгезии частиц и клеток.

Платформу syn vivo можно применять к различным другим системам, таким как доставка препаратов при раке и заболеваниях ЦНС, инфекции и воспаления, тромбозы и нарушения микроциркуляции. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы работы с микрофлюидным устройством трудно освоить, требуется привыкание к малым объемам образцов, а лучшие практики по предотвращению образования пузырьков воздуха проще передать визуально. Процедуру продемонстрирует Эшли Смит, научный сотрудник нашей лаборатории.

Микрофлюидное устройство SynVivo SMN состоит из двух наборов параллельных портов: один предназначен для подачи покрытия поверхности, функциональных групп и/или клеток для закрепления, а другой — для проведения анализа. Для начала полностью погрузите устройство в чашку Петри сm стерильной деионизированной водой и поместите чашку в вакуумную камеру. Проводите дегазацию до тех пор, пока весь воздух не будет удален из каналов устройства.

Это должно занять примерно 15 минут перед извлечением устройства из воды. Используйте остроконечный пинцет, чтобы вставить в каждый порт устройства трубку Tigon, предварительно заполненную водой. Длина трубки должна составлять примерно один дюйм.

Теперь устройство можно извлечь из воды с помощью пипетки или шприца. Нанесите каплю воды вокруг основания трубки одного из входных портов. Осторожно отсоедините трубку.

Капля воды предотвратит попадание воздуха в устройство. Далее подготовьте шприц объемом 1 мл, заполненный препаратом avadon в концентрации 20 µg/mL. Подсоедините шприц к игле из нержавеющей стали калибра 24 G и трубке. Неиспользуемый входной порт зажмите пружинным зажимом.

Вставьте трубку во входной порт устройства. Вводите avadon со скоростью потока 1 µL/min в течение 10 минут для обеспечения полной перфузии устройства. По истечении времени потока.

Зажмите все трубки зажимными клипсами и оставьте устройство при температуре 4 °C на ночь. Дождитесь достижения устройством комнатной температуры. Затем поместите устройство на перевернутый флуоресцентный микроскоп, оснащенный моторизованным предметным столиком и высокопроизводительной камерой.

Приготовьте раствор биотинилированных частиц размером 2 мкм с концентрацией 5 миллионов частиц на мл в фосфатно-солевом буфере или PBS. Загрузите частицы в шприц объемом 1 мл. Подготовьте второй шприц объемом 1 мл с PBS.

Установите каждый шприц на шприцевой насос, затем с помощью дозирующего шприца подсоедините их к иглам и трубкам. Нанесите каплю воды вокруг основания трубки входного порта и осторожно извлеките трубку, использовавшуюся для покрытия устройства. Аккуратно вставьте трубки для биотинилированных частиц и для PBS в соответствующие входные порты.

Затем начните вводить биотинилированные частицы со скоростью потока 2,5 µL/мин. Следите за входным портом под микроскопом до появления первых частиц. Запустите таймер и продолжайте подачу потока в течение трех минут.

По истечении трех минут прекратите подачу биотинилированных частиц, одновременно начав подачу PBS со скоростью потока 2,5 microliters per minute. Пропускайте PBS через устройство в течение трех минут, чтобы смыть несвязавшиеся частицы. Для начала сбора данных используйте функцию сканирования большого изображения (scan large image) в программном обеспечении для визуализации, чтобы получить изображение всего устройства, затем последовательно пронумеруйте бифуркации в устройстве и создайте круглую область интереса, диаметр которой в два раза превышает диаметр каналов.

В данном случае установите диаметр области интереса на 200 микрон, так как диаметр канала составляет 100 микрон. Используйте функцию автоматического подсчета в программном обеспечении для визуализации, чтобы экспортировать количество частиц в каждой области интереса в электронную таблицу. Аналогично, используйте функцию автоматического подсчета для экспорта общего количества частиц во всем устройстве.

Проводится CFD-моделирование, и результаты сохраняются в базе данных для дальнейшего анализа. Информация, содержащаяся в результатах, включает скорость сдвига у стенки, поток частиц по скорости и их адгезию к устройству. Эти данные используются для определения количества частиц, которые прилипают к каждой интересующей области при заданном входном значении концентрации частиц.

Для построения карты сдвиговой адгезии в качестве заключительного этапа рассчитайте процент адгезии, как подробно описано в текстовом протоколе. Постройте карту сдвиговой адгезии, используя скорость сдвига в каждом разветвлении сети и значения процента адгезии. На данном изображении показано типичное устройство syn vivo SMN с покрытием из авидина после связывания биотинилированных частиц размером два микрона.

Обратите внимание, что частицы преимущественно прикрепляются вблизи бифуркаций сети. Пронумерованные бифуркации в сети SMN syn vivo показаны здесь. На данном изображении представлена карта пристеночного сдвига, созданная с помощью CFD-модели устройства.

Скорость сдвига в устройстве варьируется от 250 inverse seconds до 15 inverse seconds, что соответствует показателям, наблюдаемым в микроциркуляторном русле in vivo. Следует отметить, что такие варьирующиеся скорости сдвига невозможно получить одновременно в линейных микрофлюидных каналах, так как в них обеспечивается постоянная скорость сдвига для каждого значения скорости потока. Представленный здесь график значений скорости сдвига в каждой из бифуркаций сети показывает, что паттерны скорости сдвига сложны и не могут быть описаны простым аналитическим соотношением, в отличие от линейных проточных каналов.

Кроме того, в сети присутствует несколько бифуркаций, попадающих в один и тот же интервал сдвига, что повышает статистическую достоверность представленных данных. Ниже приведены примеры результатов CFD-анализа потоков частиц в сети, которые используются для расчета потоков частиц в ветвях и бифуркациях экспериментальной сети.

Карта сдвиговой адгезии, рассчитанная на основе одного эксперимента SMN syn vivo, демонстрирует обратно пропорциональную зависимость, аналогичную той, что наблюдается на картах сдвиговой адгезии, полученных в экспериментах с линейными каналами. Однако при использовании анализа SynVivo одна серия экспериментов позволяет создать такую карту сдвига, в то время как для линейных каналов требуется проведение множества экспериментальных циклов. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как использовать устройства SynVivo SMN для определения сдвиговой адгезии в рамках одного эксперимента.

При проведении данного эксперимента важно помнить о том, что после подготовки микрофлюидного устройства SynVivo SMN в него не должны попасть пузырьки воздуха. Эта методика открыла перед исследователями в области воспаления возможность изучать взаимодействие лейкоцитов с эндотелием при различных скоростях сдвига в рамках одного эксперимента. В устройствах следующего поколения исследователи смогут изучать роллинг, адгезию и миграцию лейкоцитов в одном анализе, что на данный момент невозможно.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы исследования адгезии лекарственных препаратов, средств доставки лекарств и клеток для изучения таких вопросов, как физиологическое влияние потока на адгезию клетка-клетка, клетка-препарат и препарат-носитель.