VIGS-опосредованная Вперед скрининг Генетика для идентификации генов, участвующих в нехозяев сопротивления

Общая цель данной работы — продемонстрировать методологию использования вирус-индуцированного сайленсинга генов для идентификации генов, участвующих в устойчивости нехозяина, для достижения VIGs эндогенного растения. Для воздействия на целевой ген инокулируют растения Nicotiana hamama конструктом вируса тряски табака, несущим фрагмент целевого гена, затем подготавливают культуры патогена нехозяина, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок, и инокулируют их на листья растения с сайленсированным геном. Далее в темноте под воздействием УФ-света оценивают количество зеленых флуоресцентных колоний патогена нехозяина.

Для идентификации растений с сайленсингом генов, которые снижают устойчивость невирулентных хозяев, определяют целевой ген путем секвенирования вставки в вирусном векторе. В целом, данная методика прямого генетического скрининга с помощью VIGS позволяет исследователям легко выявлять гены, участвующие в устойчивости растений-нехозяев к бактериальным патогенам. За короткий период мы пришли к выводу о важности сочетания прямого генетического анализа на основе вирусного индуцированного сайленсинга генов с использованием патогенов, экспрессирующих GFP под воздействием УФ-излучения, для идентификации генов, ответственных за устойчивость по типу non-ST.

Ранее мы провели трудоемкий прямой генетический скрининг, оценивая гиперреакцию, приводящую к гибели клеток, и гибель клеток, вызванную заболеванием. Семена Nicotiana ben высевают в безземельную почвосмесь и проращивают в климатической камере. Через три недели проростки пересаживают в отдельные горшки и выращивают в теплице в течение как минимум двух-трех дней перед заражением вирусом тряски табака.

Для инокуляции векторами инжира постепенно разморозить замороженные стебли, содержащие cDNA-клоны agrobacterium. В стерильных условиях инокулировать отдельные культуры agrobacterium на чашки с агаром Luria-Bertolani. Инкубировать чашки при температуре 28 °C до двух дней.

Вырастите четыре повторности колоний для каждого клона, чтобы обеспечить достаточное количество инокулята agrobacterium для инокуляции двух растений. Инокулируйте TRV one в жидкую среду Luria berti. Соберите культуры, выращенные в течение ночи, путем центрифугирования, суспендируйте бактерии в буфере для инокуляции и инкубируйте в течение трех часов при комнатной температуре на шейкере при 50 RPM.

После сбора клеток путем центрифугирования измерьте оптическую плотность и ресуспендируйте бактериальный осадок в 5 мМ буфере MES с pH 5.5. Затем инокулируйте бактериальную культуру TRV1 с OD 600 0,3 в аксилярную сторону трех-четырех листьев Nicotiana hamama, используя шприц без иглы в месте инокуляции TRV1. В течение двух недель прокалывайте листья инокулятом соответствующих колоний TRV2 с помощью зубочистки. Содержите растения при низкой температуре с адекватным питанием, так как интенсивный рост важен для эффективного сайленсинга генов с помощью TRV.

В качестве примера в данном эксперименте используется штамм Pseudomonas syringae PV tomato T1. Патогены должны содержать плазмиду, экспрессирующую GFP. Культивируйте штаммы GFP в жидкой среде King's B с добавлением 10 µg/mL рифампицина и 50 µg/mL канамицина при 28 °C в течение 12 часов.

Соберите бактериальные культуры путем центрифугирования, затем подтвердите наличие зелетой флуоресценции с помощью длинноволновой УФ-лампы в темноте. После двух промывок в стерильной воде снова суспендируйте клетки в стерильной воде до необходимой концентрации и доведите OD 600. Затем инокулируйте соответствующие патогены на аксиальную сторону мишени.

При необходимости вырежьте из листьев с сайленсингом генов кружки диаметром около 1.5 сантиметра. Одновременно протестируйте рост нескольких патогенов, не являющихся хозяевами, на растениях с сайленсингом целевого гена; для сравнения также используйте векторный контроль. Оценивайте бактериальный рост в интервале от двух до пяти дней.

Подвергните инокулированные листья воздействию длинноволнового УФ-излучения в темноте. Обязательно используйте средства защиты кожи и органов зрения. Наблюдайте за бактериальными колониями в виде зеленых флуоресцирующих пятен на аксиальной стороне листа на фоне красной флуоресценции, излучаемой поверхностью листа.

Подтвердите наличие зеленой флуоресценции, излучаемой патогеном-хозяином, который служит положительным контролем. Ежедневно наблюдайте за ростом патогена в период от двух до пяти дней после инокуляции. Составьте список клонов, сайленсинг которых привел к росту одного или нескольких патогенов-нехозяев.

Для удаления ложноположительных результатов первого этапа скрининга повторите VIGs для выбранных клонов и снова проверьте реакцию растений с подавленным экспрессией генов на нецелевые патогены. Используйте колониальную ПЦР выбранного клона для амплификации вставки с помощью праймеров A TTB one и TB two в векторе T RV two или праймеров, фланкирующих сайт клонирования.

Проведите электрофорез продукта ПЦР в агарозном геле и подтвердите амплификацию одной полосы. Затем секвенируйте растительную генную вставку в векторе T RV two, используя либо праймеры A TTB, либо праймеры, фланкирующие сайт клонирования. Выполните blast-анализ полученной последовательности и определите характеристики гена.

Общий протокол сайленсинга большого количества генов в Nicotiana с использованием векторов на основе вируса погремушки табака. Процесс представлен на данной блок-схеме. У некоторых растений с подавленным экспрессией генов наблюдались различные фенотипические изменения, включая задержку роста, пожелтение и фенотип фотообесцвечивания.

Эти данные демонстрируют зеленую флуоресценцию патогена, подвергнутого воздействию УФ-излучения в темноте перед инокуляцией растения, и рост имплантатов через три дня после инокуляции; в качестве контроля показан тот же лист, подвергнутый воздействию белого света. В данном эксперименте отслеживается рост бактерий, экспрессирующих G-F-P-U-V, на трех растениях-нехозяевах.

Патогены использовались для демонстрации процесса идентификации растений с сайленсингом гена, восприимчивых к патогенам нехозяев, на примере растений дикого типа nicotiana hamama без сайленсинга, обладающих иммунитетом. Эти патогены не росли. Однако как минимум два патогена нехозяев росли на NB sgt.

Листья с сайленсингом одного гена. Количественные данные о бактериальном росте демонстрируют процесс идентификации растений с сайленсингом генов, у которых нарушена устойчивость к non-ST. Используя этот подход прямой генетики с помощью TGS, мы провели сайленсинг примерно 5 000 генов в Nicotiana hamana и в течение примерно полутора лет выявили растения с нарушенной устойчивостью к non-ST.

В качестве примера здесь показан рост патогенов, не поражающих растение-хозяин, на двух растениях с подавленным экспрессией генов, выявленных в ходе данного скрининга. Мы надеемся, что продемонстрировали способ проведения вирус-индуцированного сайленсинга для сотен генов с последующей оценкой подавленных растений путем наблюдения за ростом неспецифических патогенов in plano для изучения механизмов неспецифической устойчивости. Используя данный протокол вирус-индуцированного сайленсинга генов, можно подавить экспрессию сотен генов примерно за две-три недели, а затем оценивать рост помеченных GFP UV неспецифических патогенов, затрачивая около двух-трех часов в день на протяжении примерно двух-пяти дней.