Тканевая инженерия: Строительство многоклеточного 3D строительные леса на поставки слоистых сотовых листов

Общая цель этой процедуры заключается в использовании клеточных листов для создания тканевого инженерного пластыря. Это достигается путем предварительной обработки поверхности клеточной культуры термочувствительным полимером полипропилакриламидом, также называемым p-nipam. Вторым этапом является культивирование представляющих интерес клеток высокой плотности на поверхности с полимерным покрытием для создания клеточных листов.

Затем листы поднимаются путем понижения температуры пластины, что позволяет ячейкам отделяться от пластины в виде листа ячеек. Заключительным этапом является перемещение неповрежденных клеточных листов без разрыва их на конструкцию для имплантации. В конечном счете, простая световая микроскопия может быть использована для того, чтобы показать, что клеточный лист был создан и поддерживался во время манипуляций при создании имплантируемого тканевого инженерного материала.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, которые встраивают клетки в матрикс, подобно гидрогелю, заключается в том, что при использовании этого метода боковые границы клеток могут быть созданы и поддерживаться как функциональная ткань. Эти методы также могут способствовать дальнейшим исследованиям в области тканевой инженерии. Например, насколько хорошо клетки выживают после трансплантации, когда они находятся в этом организованном состоянии?

Демонстрировать эту процедуру будет доктор Уильям Тернер, постдокторант в моей лаборатории, и мисс Снапшот Сэнд. Для начала этой процедуры растворите 2,6 грамма-нипама в двух миллилитрах 60%-ного толуола, 40%-ного раствора гексана. Далее нагрейте смесь до 60 градусов Цельсия в течение 10 минут и помешивайте до тех пор, пока P nipam не растворится.

Затем разрежьте фильтровальную бумагу на круг диаметром 60 миллиметров и поместите его в воронку Бюхнера. Отфильтруйте раствор через воронку Бюхнера в предварительно взвешенный стеклянный стакан. Держите стакан и содержимое в вакууме на ночь.

После этого взвесьте стакан с-нипамом. Впоследствии добавьте изопропиловый спирт к P nipam для создания весового раствора 50 на 50 веса. Затем поместите два миллилитра раствора на поверхность планшета для культуры тканей и покройте его в течение пяти минут ультрафиолетовым светом.

Затем дважды промойте пластину двумя миллилитрами теплого PBS перед использованием ее для клеточной культуры. При этой процедуре сначала изолируют гладкомышечные клетки аорты крысы, промыв клетки двумя миллилитрами теплого PBS. Далее добавьте в клетки три миллилитра трипсина или другого расщепляющего диссоциирующего раствора и выдержите пять минут.

Затем добавьте в клетки три миллилитра питательной среды или PBS, содержащей 10% FBS. После этого соберите клетки в коническую трубку и пересчитайте их. Затем вращайте ячейки со скоростью 1000 об/мин в течение пяти минут.

Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в питательной среде. Затем поместите среду, содержащую клетки, на 35-миллиметровую термочувствительную пластину в концентрации, обеспечивающей 100% слияние, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы сохранить адгезию клеток к пластине. Теперь соберите эндотелиальные клетки и диспергируйте их в одноклеточный раствор.

Используя один х трипсин, акуат или буфер для диссоциации клеток также можно использовать для дисперсии одиночных клеток. Затем деактивируйте фермент трипсин равным количеством ингибитора трипсина сои или 10% FBS в PBS. Затем соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров

Подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра и вычисляют объем, необходимый для размеров пластыря для четырехмиллиметрового пластыря, после этого используют 2 миллиона эндотелиальных клеток, извлекают 2 миллиона клеток и помещают их в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируют клетки в течение пяти минут, отсасывают надосадочную жидкость, оставляя клетки в виде гранул в конической трубке. Теперь приготовьте гидрогель с высоким содержанием аурина в соответствии с протоколом компании.

Смешайте высокое содержание аурина и жидкий желатин в соотношении один к одному. Затем перенесите 80% от общего конечного объема в коническую трубку, содержащую гранулу, ресуспендируйте эндотелиальные клетки в смеси с высоким содержанием ауринового желатина. Далее перенесите взвешенные клетки в фиброзный матрикс.

Добавьте 20% от общего конечного объема сшивающего агента и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. На этом этапе извлеките из инкубатора 35-миллиметровую обработанную P nypa пластину, содержащую клетки, и поместите ее в колпак для клеточных культур. При комнатной температуре быстро отсасывайте среду из клеток.

Затем добавьте в тарелку два миллилитра 37 градусов Цельсия, 6% нормального желатина, пока желатин еще теплый, поместите металлическую решетку в желатин, погрузив его под поверхность нормального желатина. После этого положите всю тарелку на лед на пять-семь минут, дав желатину застыть. Через семь минут с помощью шпателя аккуратно отделите края желатина от боковой стороны тарелки.

Далее приподнимаем металлическую решетку с пластины с помощью щипцов. Перенесите лист клетки в чашку и положите его поверх волокнистой матрицы с гидрогелевой комбинацией. Добавьте два миллилитра среды с температурой 37 градусов Цельсия в планшет для культуры тканей и инкубируйте в течение ночи, чтобы лист клеток прилип к поверхности гидрогеля.

Тем временем снимите металлическую решетку после того, как раствор прогреется. Здесь клетки культивировались на поверхности, покрытой пиппой, а затем перемещались в виде листа на поверхность волокнистого матрикса. Ранние испытания, которые не переносились с металлической решеткой желатина, привели к появлению небольших рваных пятен.

Это изображение представляет собой раннюю комбинированную картинку, сочетающую в себе мито-трекер, окрашенные в красный цвет гладкомышечные клетки аорты крысы, люминесцентные эндотелиальные клетки пупочной вены человека с кальцием и изображение проходящего света. А это композит из клеточного листа в сочетании с более прочной основой волокнистой матрицы гидрогелевой комбинацией. Это составное изображение было получено из нижней части пятна через более прочный базовый волокнистый матрикс, и это составное изображение клеточных листов было получено поверх основного волокнистого матрикса.

Гидрогелевые комбинированные ячейки в листе покрывают основание волокнистой матрицы гидрогелевой комбинации, которые демонстрируют повышенную флуоресценцию по краям из-за спучивания клеток. Это просвечивающее изображение конструкции, а здесь показана автофлуоресцентная матрица естественного волокнистого основания в DPI. После этой процедуры другие эксперименты в области тканевой инженерии могут ответить на другие вопросы, например, о том, как выравнивание клеток и коммуникация влияют на успех трансплантации.

Этот метод позволяет исследователям в области тканевой инженерии исследовать сложные способы трансплантации нескольких типов клеток. Не забывайте, что работа с растворителями может быть крайне опасной. При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих масок и капюшонов для химических веществ.