Тканевая инженерия: Строительство многоклеточного 3D строительные леса на поставки слоистых сотовых листов

Общая цель данной процедуры заключается в использовании клеточных пластов для создания тканеинженерного патча. Это достигается путем предварительной обработки поверхности для культивирования клеток термочувствительным полимером полипропилакриламидом, также известным как p nipam. На втором этапе клетки, представляющие интерес, культивируют с высокой плотностью на поверхности, покрытой полимером, для формирования клеточных пластов.

Затем пласты отделяют путем понижения температуры планшета, что позволяет клеткам отсоединиться от поверхности в виде сплошного клеточного пласта. Заключительным этапом является перенос неповрежденных клеточных пластов на конструкцию для имплантации без их разрыва. В конечном итоге с помощью простой световой микроскопии можно подтвердить, что клеточный пласт был сформирован и сохранен в процессе манипуляций при создании имплантируемого тканеинженерного материала.

Основное преимущество данного метода перед существующими способами, при которых клетки встраиваются в такие матрицы, как гидрогели, заключается в том, что в данной технике латеральные границы клеток могут быть сформированы и сохранены как функциональная ткань. Эти методы также позволяют проводить дальнейшие исследования в области тканевой инженерии. Например, насколько хорошо выживают клетки после трансплантации, находясь в таком организованном состоянии?

Эту процедуру продемонстрируют доктор Уильям Тернер, postdoctoral fellow в моей лаборатории, и г-жа Snapshot. Для начала процедуры растворите 2,6 grams P nipam в двух milliliters раствора, состоящего из 60% toluene и 40% hexane. Затем нагрейте смесь до 60 °C в течение 10 минут и перемешивайте до полного растворения P nipam.

Затем вырежьте из фильтровальной бумаги круг диаметром 60 миллиметров и поместите его в воронку Бюхнера. Профильтруйте раствор через воронку Бюхнера в предварительно взвешенный стеклянный стакан. Храните стакан с содержимым в вакуумном эксикаторе в течение ночи.

После этого взвесьте стакан с p nipam. Затем добавьте к P nipam изопропиловый спирт для приготовления раствора с массовой долей 50:50. Далее нанесите два миллилитра раствора на поверхность планшета для культивирования тканей и подвергните воздействию УФ-излучения в течение пяти минут для формирования покрытия.

Затем дважды промойте планшет двумя миллилитрами теплого PBS перед использованием для культивирования клеток. В данной процедуре сначала изолируйте гладкомышечные клетки аорты крысы, промыв клетки двумя миллилитрами теплого PBS. Затем добавьте к клеткам три миллилитра трипсина или другого расщепляющего диссоциирующего раствора и инкубируйте в течение пяти минут.

Затем добавьте к клеткам три миллилитра культуральной среды или PBS, содержащего 10% FBS. После этого соберите клетки в коническую пробирку и проведите их подсчет. Затем центрифугируйте клетки при 1000 RPM в течение пяти минут.

Отсоси супернатант и ресуспендируй клетки в ростовой среде. Затем перенеси среду с клетками на 35-миллиметровую термочувствительную пластину в концентрации, обеспечивающей 100% конфлюэнтность, и инкубируй при 37 °C в течение ночи для обеспечения адгезии клеток к пластине. Теперь соберите эндотелиальные клетки и диспергируйте их, чтобы получить суспензию одиночных клеток.

Для диспергирования клеток до состояния отдельных клеток также можно использовать 1x трипсин, Accutase или буфер для диссоциации клеток. Затем инактивируйте фермент трипсин равным количеством ингибитора трипсина из сои или 10% FBS в PBS. После этого соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.

Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и рассчитайте объем, необходимый для размеров патча; для патча размером четыре миллиметра используют 2 миллиона эндотелиальных клеток. После этого отберите 2 миллиона клеток и поместите их в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем центрифугируйте клетки в течение пяти минут и аспирируйте супернатант, оставив клетки в виде осадка в конической пробирке. Теперь приготовьте гидрогель high aurin в соответствии с протоколом компании.

Смешайте раствор аурина с высокой концентрацией и жидкий желатин в соотношении один к одному. Затем перенесите 80% от общего конечного объема в коническую пробирку с осадком и ресуспендируйте эндотелиальные клетки в смеси желатина с аурином. После этого перенесите суспендированные клетки в фиброзный матрикс.

Добавьте кросслинкер в объеме 20% от общего конечного объема и инкубируйте при 37 °C в течение одного часа. На этом этапе извлеките из инкубатора 35-миллиметровую планшетку с обработанными клетками P nypa и поместите ее в ламинарный шкаф для культивирования клеток. При комнатной температуре быстро аспирируйте среду из лунок с клетками.

Затем, пока желатин еще теплый, добавьте в чашку два миллилитра 6% обычного желатина при температуре 37 °C, поместите металлическую решетку в желатин, погрузив ее ниже поверхности обычного желатина. После этого поместите всю чашку на лед на пять–семь минут, чтобы желатин затвердел. Через семь минут с помощью шпателя осторожно отделите края желатина от стенок чашки.

Затем с помощью пинцета поднимите металлическую решетку с планшета. Перенесите пласт клеток в чашку и поместите его поверх комбинации фиброзного матрикса и гидрогеля. Добавьте два миллилитра среды при 37 °C в планшет для культивирования тканей и инкубируйте в течение ночи, чтобы пласт клеток прикрепился к поверхности гидрогеля.

Тем временем, после прогревания раствора, извлеките металлическую решетку. В данном случае клетки культивировали на поверхности, покрытой Pippa, а затем переносили в виде пласта на поверхность волокнистого матрикса. В ходе предварительных испытаний перенос без использования желатиновой металлической решетки приводил к образованию небольших разрозненных фрагментов.

На данном изображении представлен композитный снимок раннего прототипа патча, объединяющий изображения клеток гладкой мускулатуры аорты крысы, окрашенных MitoTracker Red, эндотелиальных клеток пупочной вены человека, окрашенных Calcium AM Green, и изображение в проходящем свете. Далее представлен композитный снимок слоя клеток, совмещенного с более прочным базовым фиброзным матриксным гидрогелем. Данное композитное изображение было получено со стороны основания патча через прочный базовый фиброзный матрикс, а композитный снимок клеточных слоев был сделан поверх базового фиброзного матрикса.

Клетки в гидрогелевом сочетании на листе покрывают базовый фиброзный матрикс в гидрогелевом сочетании, который демонстрирует повышенную флуоресценцию по краям из-за скопления клеток. Здесь представлено трансмиссионное изображение конструкции, на котором виден автофлуоресцентный природный фиброзный базовый матрикс в DPI. После выполнения данной процедуры другие эксперименты по тканевой инженерии могут дать ответы на такие вопросы, как влияние выравнивания и взаимодействия клеток на успех трансплантации.

Данный метод позволяет исследователям в области тканевой инженерии изучать сложные способы трансплантации нескольких типов клеток. Не забывайте, что работа с растворителями может быть крайне опасной. При выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих масок и работа в химическом вытяжном шкафу.