Автоматизированная, Количественный Когнитивная / Поведенческие Скрининг мышей: Для генетики, фармакологии, животных познания и Бакалавриат Инструкции

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы провести скрининг генетически и фармакологически модифицированных мышей на предмет сбоев и основных механизмов познания. Это достигается за счет проведения психофизических измерений физиологически значимых количественных свойств в полностью автоматизированной высокопроизводительной системе поведенческого фенотипирования. Следующим шагом является анализ и построение графиков поступающих данных в квазиреальном времени, что позволяет автоматизировать управление тестированием в режиме реального времени на основе мыши.

Далее исходные данные, код тестового протокола и вся промежуточная статистика архивируются в единой структуре данных. Чтобы сделать данные общедоступными и стимулировать дальнейший анализ, результаты показывают специфические для деформации изменения временной фракции пара в зависимости от задачи переключения. Основное преимущество этой техники перед другими методами, такими как водный лабиринт, заключается в том, что она дает физиологически значимые результаты, очень высокую пропускную способность и отсутствие контактов с мышами.

Таким образом, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области когнитивной нейрогенетики, такие как существуют ли мутантные штаммы, которые имеют количественно измененные временные механизмы? Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику генетического когнитивного дефицита, поскольку он может привести к открытию генов, определяющих критические компоненты этих механизмов. Новички в этом методе должны понимать основы программирования MATLAB и понимать силу количественного автоматизированного психофизического тестирования.

Идея создания этой системы пришла нам с Адамом в голову, когда мы увидели трудоемкий и неколичественный характер испытаний, которые проводились на генетически модифицированных мышах. Мы установили систему поведенческого тестирования в стандартной лабораторной комнате с 10 шкафами на комнату и восемью тестовыми средами на шкаф. Это позволяет одновременно запускать 80 мышей. Каждая тестовая среда состоит из полипропиленовой ванны для мыши, соединенной акриловой трубкой с тестовой коробкой для мыши.

Испытательный бокс имеет три бункера, которые контролируются инфракрасными лучами. Два внешних бункера имеют прикрепленные питатели гранул и могут подавать пищевые гранулы, в то время как средний бункер не подает пищевые гранулы. Кабели, проходящие через порт в боковой стене, соединяют тестовые среды с электрическими интерфейсными платами и выделенными компьютерами в другой комнате, на которых выполняются программы управления протоколами.

На каждые два шкафа требуется один компьютер. Эти компьютеры подключены через локальную сеть к серверу, на котором установлено программное обеспечение для анализа данных и построения графиков. Настройте локальную сеть таким образом, чтобы сервер, на котором установлено программное обеспечение для анализа данных, мог получить доступ к жестким дискам компьютеров, управляющих тестовыми средами.

Затем создайте учетную запись синхронизации файлов для хранения данных в облаке. Добавьте системную папку TS и ее подпапки в путь поиска MATLAB и убедитесь, что системная папка TS является папкой, синхронизированной с облаком. Система TS представляет собой программную библиотеку с открытым исходным кодом, содержащую более 30 высокоуровневых функций, написанных в MATLAB, которые облегчают создание сложного кода для анализа данных и построения графиков данных.

В системном наборе инструментов TS функция Ts начинает создавать иерархическую структуру данных, в которую необработанные данные и все полученные из них результаты будут помещены другими функциями в системном инструментарии TS. Затем вызовите ts add protocol, чтобы указать параметры управления для экспериментального протокола, указать код решения, который автоматизирует принятие решения о прекращении протокола и переходе к следующему, а также указать критерии решения, которые будут использоваться. Теперь поместите мышей в 24 7 тестовых сред, по одной мыши на среду.

Обратите внимание на идентификационный номер мыши, номер коробки и букву, обозначающую компьютер управления экспериментом в локальной сети, а также его IP-адрес. Следующий вызов, ts start session, чтобы начать экспериментальную сессию. Экспериментальные сессии длятся от одной до двух недель, в течение которых запускается несколько различных протоколов поведенческого тестирования.

Затем на одном управляющем компьютере вызовем макрос, который запустит все коробки, управляемые этим компьютером. Этот макрос был создан сессией запуска TS. Повторите то же самое на других управляющих компьютерах.

Анализ данных может быть выполнен путем написания нового кода анализа данных и построения графиков с помощью команд в наборе инструментов системы TS или путем использования или изменения существующего кода анализа данных и построения графиков, предоставленного в библиотеке TS. После начала эксперимент в основном выполняется сам по себе, хотя на протяжении всего эксперимента требуется некоторый контроль. Отслеживайте электронную почту на предмет предупреждений от программы анализа данных системы TIA, указывающих на возможные неисправности оборудования, такие как сбои питания, спонтанное управление, перезагрузка компьютера и неисправности питателя гранул.

Эти оповещения по электронной почте позволяют своевременно устранять неисправность два-четыре раза в день. Графики производительности, которые генерирует код, анализирующий данные системы TS, каждый раз при его вызове таймером анализа. Эти участки можно контролировать из любой точки мира в любое время, а при необходимости протокол эксперимента может быть пересмотрен в режиме онлайн удаленно с места, где мышей тестируют.

Также используйте браузер TS для изучения данных и сводной статистики в иерархической структуре данных по мере их появления в квазиреальном времени: графики кумулятивного дисбаланса в режиме реального времени для полученных гранул, называемых доходами, отображаются красным цветом, а продолжительность посещения - черным цветом для трех мышей дикого типа и трех гетерозигот L-одногоготы. Изменение графика произошло в точке, где склоны поворачивали вниз, отмеченном вертикальными пунктирными красными линиями для трех мышей. Наклон кумулятивного дисбаланса посещений черная линия точно повторяет наклон кумулятивного дисбаланса доходов.

Красная линия, это указывает на почти идеальное совпадение отношения средней продолжительности посещения к соотношению доходов. Обратите внимание, как быстро соотношение продолжительности визитов приспосабливается к изменению соотношения доходов в точках перегиба в сторону понижения. С другой стороны, другая мышь не совпала во время вторых сеансов кормления, о чем свидетельствует нулевой наклон совокупного посещения.

График дисбаланса дюрации выделен черным цветом, в то время как наклон дисбаланса доходов красным цветом существенно положительный. Однако во время третьей фазы кормления наклоны параллельны, а это означает, что эта мышь начала резко в начале этой фазы, чтобы привести свой коэффициент посещения в соответствие с коэффициентом дохода. Таким образом, очевидно, что он был способен это сделать, но по каким-то причинам не сделал этого во время части испытаний.

Это иллюстрирует важность визуализации всего хода работы, а не полностью полагаться на несколько сводных статистических данных. Эта мышь точно совпадала во время первого коэффициента дохода, но когда он был обратным, мышь не полностью переворачивала другую мышь, превосходящую по сравнению во время третьей фазы кормления. То есть дисбаланс в среднем посещении был больше, чем дисбаланс средних доходов, и он не полностью приспособился к обращению вспять дисбаланса доходов.

Обратите внимание, однако, что все шесть мышей, оба диких типа и три гетерозиготы, точно совпадали в течение самой первой четырехчасовой фазы кормления и демонстрировали резкую реакцию на изменение соотношения доходов. Это демонстрирует неповрежденное функционирование у гетерозигот многих основных механизмов познания, таких как длительность, оценка, число, оценка скорости оценки, пространственная локализация и способность запоминать простые абстрактные величины. В когнитивной нейрогенетике так же важно определить, что все еще работает нормально, как и найти то, что не работает или имеет некоторые интересные количественные изменения в своей работе.

Кумулятивные циклы или посещение бункера номер один, за которым следует посещение бункера номер два, а затем возвращение в бункер номер один, строятся в зависимости от времени сеанса. Здесь пунктирными зелеными вертикалями обозначены начало фаз кормления. Сплошные красные вертикали отмечают.

Скорость, с которой мышь начинает циклически перемещаться между бункерами, является мерой того, что можно назвать ее смелостью или склонностью к исследованию. Пять из шести показали некоторое исследование до начала первой фазы кормления и начали резко переключаться между бункерами, как только она началась. Одна мышь, однако, не проявила никакого исследовательского поведения, ни одного цикла до середины второй фазы кормления, когда она резко начала переключаться между бункерами.

Анализ инструментальных и классических экспериментов по обусловливанию дает кумулятивные данные о скоростях начала испытаний. В этих экспериментах измерялась скорость обучения, то есть количество пар до появления условного поведения. Вертикальными пунктирными линиями отмечена пробная попытка приобретения в каждой записи.

Испытание приобретения является первым испытанием, в котором наблюдается значительное увеличение скорости начала исследования при условии, что новая более высокая скорость превышает скорость в первом сегменте. Это положение о лестнице необходимо, потому что иногда происходит значительное снижение до первого значительного повышения. Здесь показано кумулятивное распределение задержек при инициировании исследования.

Точка над осью X, в которой горизонтальная линия на 0,5 пересекает кумулятивное распределение, является медианной задержкой для начала исследования. Здесь приведены совокупные данные о разнице между скоростью выталкивания во время работы загрузочного бункера и скоростью выдавливания в течение предыдущего межпробного интервала. Изначально наклон этой записи равен нулю или отрицательный, потому что мышь тыкает меньше во время освещения бункера, чем во время межпробного интервала.

Наклон становится положительным, когда мышь начинает засовывать в освещенный бункер в ожидании скорой сдачи апелляционного суда. Сплошными точками отмечена точка, в которой наклон становится положительным, что является испытанием, при котором условная реакция впервые надежно проявляется на этих графиках. Синие линии — это эмпирические функции кумулятивного распределения, показывающие кумулятивное распределение задержек переключения для одной мыши при трех различных настройках задержки подачи в длинном бункере.

Тонкие красные кривые, которые почти точно накладываются на эмпирические функции, являются шестью функциями белги, соответствующими этим данным. Жирные красные линии — это соответствующие функции плотности вероятности для распределений смеси белги. Сокращение длительной задержки подачи привело к тому, что мышь сократила среднее значение задержки переключения и повысила их точность.

Это также привело к появлению некоторых импульсных переключателей, о чем свидетельствует выпуклость в левом хвосте функции плотности вероятности на нижнем графике. Мерой этой импульсивности является доля смеси, относимая к компоненте Вейбеля наилучшим вариантом распределения смеси Вейбеля-Гаусса. В этом анализе короткие испытания отмечены крошечными красными плюсами в нижней части графика, в то время как длинные испытания отмечены крошечными красными плюсами в верхней части графика.

Изменение плотности образующихся красных полос внизу и вверху указывает на изменение относительной частоты коротких и длинных испытаний. Задержки переключения отмечены маленькими разомкнутыми кружками. Обратите внимание, что когда красный цвет внизу становится более плотным, что означает, что короткие попытки более вероятны, маленькие круги смещаются вверх, а когда красный цвет вверху становится более плотным, что означает увеличение вероятности длинных попыток, круги смещаются вниз.

Синие линии — это медианы распределений. Здесь показан 24-часовой растровый график поведенческих событий и событий окружающей среды за 90-дневный тестовый период. Черные точки фиксируют толчки, а красные и зеленые точки фиксируют подачу гранул в два загрузочных бункера.

Первые черные треугольники фиксируют выключение света, в то время как вторые черные треугольники записывают огни на первом столбце голубых треугольников, которые регистрируют наступление интервала кормления в сумерках, которое происходит за час до самих сумерек, а второй столбец голубых треугольников записывает смещение интервала кормления в сумерках, которое происходит через три часа после выключения света. Эти пурпурные треугольники записывают беззнаковое начало интервалов кормления на рассвете, которое происходит за два часа до появления света, а последний столбец пурпурных треугольников записывает смещения кормления на рассвете. Начало упреждающей активности кормления до начала кормления в сумерках отмечено синими звездочками в период от шести до 15 дней.

После начала тестирования мыши начинают проявлять активность упреждающего тыкания пищи за час или около того до сумеречного интервала кормления, что указывает на формирование циркадной памяти. Гетерозиготы, содержащие мутацию в гене Lone, демонстрируют большую точность определения интервалов времени, чем их однопометники дикого типа. На этом рисунке показано кумулятивное распределение оценок точности для контрольной группы дикого типа в виде сплошных линий, а их зиготических собратьев по помету в виде пунктирных линий при прохождении блоками испытаний со все более узкими интервалами между временными целями, что показано цветовыми различиями.

Напротив, гетерозиготы, несущие морду летучей мыши или мутацию BFC, демонстрируют более низкую точность интервала времени, чем их контрольная группа, пошедшая диким типом. Как только вы освоите эту технику, тестирование можно будет провести всего за один день или за несколько недель. Для подбора требуется всего один день еды.

Опережающее обучение занимает две-три недели.