Имитация поджелудочной Нейропластичность:

Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении реактивных изменений периферических нейронов в ответ на различные микроокружения поджелудочной железы. Это достигается путем первоначального получения лизатов всей ткани нормальной поджелудочной железы человека и пораженной ткани поджелудочной железы. На втором этапе из новорожденных крыс выделяют клетки спинальных ганглиев (DRG), которые затем подвергают воздействию полученных лизатов тканей.

Затем, после инкубации в течение 48 часов, клетки фиксируют для последующего двойного иммунофлуоресцентного окрашивания. Результаты демонстрируют различия в плотности нейритов, характере их ветвления и плотности глии нейронов, культивируемых в различных экстрактах тканей. Данный метод может способствовать проведению исследований в области нейрогастроэнтерологии, например, изучению роли молекулярных медиаторов нейропластических изменений при различных заболеваниях ЖКТ.

Хотя этот метод позволяет изучить различные нейротрофические характеристики заболеваний поджелудочной железы, его также можно применять к другим системам, таким как рак или воспалительные состояния всего желудочно-кишечного тракта. Идея использовать этот метод возникла у нас, когда мы начали сотрудничать с исследователями в области нейропатических заболеваний в педиатрии, например, при болезни Онга, и применили этот подход для наших целей. Для гомогенизации ткани поджелудочной железы человека перенесите кубики ткани размером 5 by 5 by 5 мм непосредственно из среды при -80 °C в жидкий азот.

Затем поместите замороженные блоки сначала в пробирки для гомогенизации, в которых может находиться металлический шарик для диссоциации, а затем в гомогенизатор тканей и проведите гомогенизацию, не допуская размораживания ткани сразу после диссоциации. Ресуспендируйте полученный гомогенат в виде твердого порошка в 300–500 µL ледяного 0.1 X PBS. Не используйте лизирующий буфер, так как это может.

Лизируйте нейроны, затем центрифугируйте гомогенат при 21 130 ×g при температуре 4 °C в течение не менее 15 минут. Соберите прозрачный супернатант, содержащий экстракт ткани; для сбора супернатанта клеточных линий из линий клеток поджелудочной железы человека культивируйте клетки до достижения слияния не менее 70–80% в нормальной ростовой среде.

Когда клетки будут готовы, промойте их не менее трех раз культуральным фосфатно-солевым буфером (PBS) и культивируйте в безсывороточной среде в течение периода до 48 часов. Затем измерьте концентрацию белка в гомогенате тканей или супернатантах клеточных линий с помощью метода Брэдфорда. После этого разделите экстракты тканей и супернатанты клеточных линий на аликвоты таким образом, чтобы конечная концентрация экстракта или супернатанта в нейрональной среде составляла 100 µg/mL.

И храните их при температуре -80 °C. Используя новорожденную крысу в возрасте от P2 до P12 с отделенной головой, рассеките кожу и обнажите позвоночный столб. Затем выполните переднюю ламинэктомию, чтобы обнажить спинной мозг.

Затем обнажите и извлеките спинальные ганглии задних корешков (DRG). Поместите DRG в ледяную среду MEM с добавлением гентамицина и метронидазола. Продолжайте сбор DRG, начиная с каудальных и продвигаясь к верхним шейным ганглиям.

По завершении соберите 52 DRG, что будет достаточно для 24-луночного планшета. Затем с помощью микроножниц отделите DRG от корешков и нервов. После этого отсеките все оставшиеся периферические и центральные отростки.

После сбора DRG инкубируйте их в HBSS с добавлением коллагеназы второго типа при 37 °C в течение 20–30 минут. После инкубации тритурируйте DRG через шприцы с уменьшающимся диаметром.

Обратите внимание, что избыток трипсина может привести к гибели нейронов, однако он менее губителен для глии. Когда среда, содержащая DRG, помутнеет, центрифугируйте суспензию при 93.9 ×g в течение пяти минут. Затем удалите среду и ресуспендируйте осадок.

Суспендируйте клетки в нейробазальной среде для подготовки их к культивированию. Используйте гемоцитометр для оценки общего количества нейронов и глии. Затем высейте клетки на предварительно покрытые покровные стекла диаметром 13 мм.

Выбор покрытия для 24-луночного планшета зависит от целей эксперимента. Затем заполните лунки нейробазальной средой и оставьте клетки для прикрепления к лункам на ночь. На следующий день разморозьте среду, дополненную экстрактом ткани, или среду, дополненную супернатантом клеточной линии.

Затем аспирируйте среду для посева из DRG и при необходимости проведите очень осторожное промывание PBS. Затем медленно нанесите пипеткой на клетки среду с добавлением тканевого экстракта или супернатант клеточной линии, разведенный до концентрации 100 µg/mL. Оставьте клетки расти в течение 48 часов при 37 °C в среде с тканевым экстрактом или супернатантом клеточной линии.

Отоссикайте среду и зафиксируйте образец в 4% параформальдегиде для иммуноокрашивания. Для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания используйте нейрон-специфические и глия-специфические маркеры для анализа морфогеометрии. Используйте инвертированный световой микроскоп, оснащенный CCD-камерой, в сочетании с автоматизированным программным обеспечением для измерения плотности нейритов при 200-кратном увеличении.

Измерьте плотность нейритов в культурах нейронов, наложив сетку размером 50 на 50 микрон и подсчитав плотность волокон на квадрат путем подсчета пересекающихся волокон. Повторите этот анализ для четырех различных областей с наиболее интенсивным ростом на четырех-пяти репрезентативных фотомикрографиях для каждого покровного стекла. Измерьте среднее количество ветвлений на нейрон, среднюю длину ветвей и размер перикариона при оценке роста нейритов для 30 случайно выбранных одиночных нейронов с каждого покровного стекла, маркируя нейриты и перикарионы; здесь представлены нейроны DRG, культивируемые с экстрактом тканей нормальной поджелудочной железы.

Напротив, нейроны Ганглиев спинальных нервов (DRG), культивируемые с экстрактами тканей при хроническом панкреатите или раке поджелудочной железы, демонстрируют более высокую плотность нейритов. Здесь представлены нейроны межмышечного сплетения, культивируемые с различными экстрактами тканей поджелудочной железы человека.

Нейроны миэнтерического сплетения, выращенные в экстрактах при хроническом панкреатите или раке поджелудочной железы, становятся длиннее и демонстрируют более сложную структуру ветвления, чем нейроны, выращенные в экстрактах нормальной поджелудочной железы. При культивировании нейронов спинальных ганглиев (DRG) с супернатантом клеток рака поджелудочной железы также наблюдалось увеличение плотности нейронов, аналогичное тому, что было отмечено при использовании тканевых экстрактов. Однако это увеличение было обратимым при истощении или блокировании определенных нейротрофических факторов, таких как нейротрофины или фактор роста нервов.

Клетки Ggl также по-разному реагируют на различные экстракты тканей поджелудочной железы: экстракты при хроническом панкреатите или раке поджелудочной железы усиливали рост глии и увеличивали количество глиальных клеток в культурах глии, полученных из DRG. При этом эффект был более выражен при использовании экстрактов из тканей с раком поджелудочной железы, чем при хроническом панкреатите. После освоения данной методики ее выполнение занимает от четырех до пяти часов при условии правильного соблюдения протокола после разработки.

Этот метод открыл исследователям в области нейрогастроэнтерологии путь к изучению механизмов нейропластичности при различных заболеваниях ЖКТ, включая воспалительные и злокачественные расстройства. После просмотра этого видео вы получите детальное представление о том, как изолировать периферические нейроны для изучения нейропластичности поджелудочной железы, а также о том, как использовать эту систему и другие методы анализа нейропластичности и нейрональных изменений при заболеваниях ЖКТ.