Ответ Протокол Хоботок Расширение для исследования поведенческой пластичности в насекомых: применение к основным, биомедицинских и сельскохозяйственных исследований

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ реализации поведенческого обусловливания простого рефлекторного ответа на пищу у медоносных пчел. Это достигается путем первоначального отлова пчел, их фиксации в специальных удерживающих устройствах (гарнитурах), скармливания небольшого количества секреторного раствора и последующего привыкания насекомых к фиксации. Затем для обусловливания отбираются особи, проявляющие достаточную мотивацию при касании их антенн сахарозой.

В процессе кондиционирования предъявление запаха сочетается с вознаграждением в виде сахарозы для вызывания условного рефлекса. Затем в ходе не подкрепляемых проб измеряют наличие или отсутствие ответа, латентный период ответа и продолжительность ответа. Заключительным этапом является анализ данных и графическое представление результатов проб кондиционирования и тестирования.

Данный метод был успешно применен в исследованиях биологии и здоровья медоносных пчел; обучающее поведение особенно чувствительно к воздействию таких деструктивных факторов, как пестициды, что позволяет оценить влияние подобных воздействий на поведение пчел при сублетальных дозах. Визуальная демонстрация этого метода помогает понять временные интервалы предъявления стимула, необходимые для эффективного обусловливания, а также выявить распространенные ошибки, снижающие эффективность процесса. Лицу, впервые знакомящемуся с данным методом, будет сложно уделить должное внимание деталям, необходимым как для соблюдения протокола, так и для обеспечения соответствующих окружающих условий.

Для начала соберите рабочих пчел у летка колонии, когда они делают паузу перед вылетом или возвращаются с фуражировки. Помещайте в каждый флакон только одну пчелу. При закрытии крышки держите горлышко флакона горизонтально или направленным вниз, чтобы предотвратить побег насекомого.

После сбора пчел вернитесь в лабораторию и помещайте пробирки по несколько штук в ледяную водно-солевую смесь. Как только пчела станет неподвижной, немедленно извлеките пробирку из льда, чтобы избежать чрезмерного воздействия холода, и поместите пчелу в фиксирующее устройство. Зафиксируйте пчелу так, чтобы ее дорсальная часть груди была обращена к вырезу держателя, а голова находилась чуть выше его верхнего края.

Осторожно прижмите пчелу так, чтобы ротовые органы вышли за край держателя. Просуньте полоску армированного скотча между головой и грудью с дорсальной стороны и плотно прикрепите свободный конец к боковой части держателя. Убедитесь, что лента шлейфа лежит ровно и натянута.

Между передней частью держателя для пчелы и лентой не должно быть заметных зазоров. При наличии зазоров пчела может не иметь возможности правильно вытянуть per bois или может сбежать. Перед началом кормления дайте пчелам около 30 минут, чтобы они восстановились после закрепления в сбруе.

Затем, в месте, расположенном далеко от зоны обучения, в интервале между кормлением и обусловливанием скормите каждой пчеле примерно три-четыре µL 0,5 М сахарозы. Поместите пчел в тихое место в лаборатории в пластиковый контейнер с влажными бумажными полотенцами. В течение этого времени, за несколько минут до начала обусловливания, стимулируйте мотивацию пчел к питанию, коснувшись их антенн маленькой каплей 0,5 М раствора сахарозы.

Не позволяйте пчелам кормиться во время этого теста. Если они реагируют вытягиванием хоботков, значит, они, вероятно, достаточно мотивированы для обучения и могут быть использованы в протоколе. Когда всё будет готово, поместите стеклянный шприц для запаха в держатель из модельной глины и отрегулируйте его так, чтобы отверстие в широком конце было направлено непосредственно на пчел. Конец шприца должен находиться на расстоянии одного-двух сантиметров от пчелы; надежно закрепите фитинг, соединяющий картридж с трубками воздушного потока и системой клапанов, над узким концом шприца.

В начале каждого испытания поместите закрепленную пчелу на штифт в арене кондиционирования так, чтобы ее усики были направлены непосредственно к картриджу с запахом. Дайте пчеле отдохнуть в арене от 15 до 25 секунд перед подачей запаха, чтобы она привыкла к новым условиям окружающей среды. Нажмите кнопку пуска, чтобы запустить механизм отсчета времени для подачи запаха.

Наблюдайте за реакцией пчелы на запах после начала стимуляции и до предъявления безусловного стимула. После каждого испытания дайте пчеле отдохнуть в зоне кондиционирования еще от 15 до 25 секунд для первоначального формирования памяти. Слишком раннее перемещение пчелы после испытания значительно снизит эффективность каждого сеанса кондиционирования.

Чтобы ввести сахарозу, удерживайте кончик иглы на расстоянии двух-трех сантиметров от пчелы во время предъявления запаха. Используйте край тренировочной арены, чтобы избежать встряхивания шприца, так как это движение может отвлечь пчелу. Во время предъявления ольфакторного стимула будет звучать сигнал к кормлению.

Как только прозвучит сигнал к кормлению, слегка коснитесь усиков, пока пчела не вытянет хоботок, затем покормите пчелу. Время между предъявлением запаха и подачей сахарозы имеет решающее значение. В идеале эти два стимула должны кратковременно перекрываться.

Если между предъявлением запаха и предъявлением сахарозы пройдет более нескольких секунд, эффективность обусловливания снизится. После завершения обучения используйте не подкрепляемые тестовые пробы, чтобы оценить, насколько хорошо пчелы запомнили сформированную ассоциацию. Сначала установите видеокамеру на штативе над зоной обучения и сфокусируйте её на передней части головы пчелы так, чтобы антенны и хоботок были в резком фокусе.

Убедитесь, что небольшой светодиодный индикатор, сигнализирующий о подаче запахового стимула, расположен позади пчелы в зоне видимости видеокамеры, но так, чтобы пчела его не видела. Это позволит определить время начала и окончания подачи запаха при анализе. Для получения наиболее воспроизводимых результатов используйте свежеприготовленные картриджи с запахами после завершения всей настройки оборудования.

Начните тестирование, представив запах, как показано ранее. Начните запись за 20 секунд до предъявления запаха и продолжайте запись в течение как минимум 20 секунд после этого. После тестирования используйте программное обеспечение для редактирования видео, чтобы оценить реакцию каждой пчелы на предъявленный стимул.

Используйте бинарную систему оценки для анализа реакции вытягивания хоботка, классифицируя ответы как положительные или отрицательные. Ответ особи B оценивайте как положительный в том случае, если хоботок особи B вытягивается за линию, соединяющую кончики раскрытых мандибул, строго после начала подачи запаха, но до прекращения его подачи. Ответ особи B оценивайте как отрицательный, если в течение испытания вытягивание хоботка отсутствует или если хоботок вытягивается после прекращения подачи одоранта. Могут быть собраны и другие параметры, такие как латентный период до вытягивания, а также количество и общая продолжительность реакций вытягивания для данного условия.

Интенсивность стимула увеличивалась в ходе последующих сессий кондиционирования. Ответы на новые тестовые запахи, которые отличались от стимула длиной углеродной цепи и/или положением углерод-углеродной связи, снижались пропорционально степени различия между кондиционирующим стимулом и новым тестовым запахом. Эти данные иллюстрируют вариабельность и успешность кондиционирования при проведении опыта новыми исследователями.

Реакции на октал различались в зависимости от группы, проводившей тестирование. В ходе тестовых проб запах, использовавшийся в качестве условного стимула, вызывал наиболее сильную реакцию. Когда в качестве условного стимула использовался октал, при тестировании наблюдалась более сильная реакция по сравнению с метилциклоном — новым запахом.

Аналогичным образом, метилциклопентан вызывал более выраженные реакции, когда он использовался в качестве условного стимула. При использовании обратного сочетания условный рефлекс снижался почти до уровня реакции на новый запах, что иллюстрирует важность точного времени для успешного формирования обусловленности. После своей разработки этот метод открыл исследователям в области нейробиологии путь к изучению нейронных основ обучения и памяти на модельных организмах насекомых, таких как медоносная пчела.

Не забывайте, что работа с насекомыми, особенно с медоносными пчелами, может быть опасной. Обязательно используйте соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с этими животными.