Ответ Протокол Хоботок Расширение для исследования поведенческой пластичности в насекомых: применение к основным, биомедицинских и сельскохозяйственных исследований

Протокол обусловливания Proboscis Extension Response (PER), разработанный для медоносной пчелы (Apis mellifera), предоставляет экологически значимые и легко поддающиеся количественной оценке средства для изучения нескольких различных механизмов обучения у многих видов насекомых.

Общая цель данной процедуры – показать, как реализовать поведенческое обусловливание простой рефлексивной реакции на пищу у медоносных пчел. Это достигается путем сначала отлова медоносных пчел, удержания их в жгутах, кормления их небольшим количеством секретного раствора, а затем предоставления им возможности привыкнуть к удерживанию. Далее отбираются бусины для обусловливания, которые проявляют достаточную мотивацию при прикосновении к их антеннам сахарозой.

Во время обусловливания представление запаха сочетается с вознаграждением сахарозой, чтобы вызвать условную реакцию. Далее, в неподкрепленных испытаниях измеряют наличие или отсутствие ответа, латентность ответа и продолжительность ответа. Заключительным этапом является анализ данных и графическое представление испытаний по кондиционированию и испытаниям.

Этот метод был успешно применен в исследованиях биологии медоносных пчел и здорового образа жизни, особенно чувствительных к разрушительным методам обработки, таким как пестициды, что позволяет оценить влияние этих типов обработки на поведение медоносных пчел на сублетальных уровнях. Визуальная демонстрация этого метода помогает понять время стимула, необходимое для эффективного обусловливания, и распространенные ошибки, снижающие эффективность. Человек, плохо знакомый с этим методом, будет испытывать трудности с вниманием к деталям, необходимым как от протокола, так и от окружающих условий.

Для начала собирайте рабочих пчел у входа в колонию, когда они останавливаются перед отлетом или когда возвращаются с кормовой работы. Ловите только одну пчелу в одном флаконе. Удерживайте отверстие флакона горизонтально или лицом вниз, фиксируя крышку, чтобы предотвратить утечку.

Как только пчелы будут собраны, вернитесь в лабораторию и поместите несколько флаконов за раз в ледяную водную жижу. Как только пчела станет неподвижной, немедленно снимите флакон со льда, чтобы избежать передержки, и поместите пчелу в удерживающий жгут. Удерживайте пчелу так, чтобы ее спинная грудная клетка была обращена к отрезанной части держателя, а голова была прямо над верхом.

Аккуратно надавите на пчелу так, чтобы ее ротовые части выходили за край держателя. Проденьте полоску клейкой ленты между головой и грудной клеткой с тыльной стороны и прочно прикрепите свободный конец к боковой стороне держателя. Убедитесь, что лента на ремне безопасности гладкая и натянутая.

Между передней частью пчелодержателя и лентой не должно быть заметных зазоров. Если есть щели, пчела может быть не в состоянии должным образом вытянуть свой perbois или она может убежать. Дайте пчелам около 30 минут на восстановление после обвязки перед кормлением.

Затем в зоне, удаленной от тренировочной зоны, накормите каждую пчелу примерно тремя-четырьмя микролитрами сахарозы 0,5 моляра в интервале между кормлением и кондиционированием. Поместите пчел в тихую зону лаборатории и в пластиковый контейнер с влажными бумажными полотенцами. В течение этого времени, за несколько минут до начала кондиционирования, теста стимулируют питание, прикасаясь к своим усикам небольшой каплей 0,5 молярного раствора сахарозы.

Не позволяйте им кормить во время этого теста. Если они реагируют расширением своего псис, они, вероятно, достаточно мотивированы для обучения и могут быть использованы для протокола. Когда все будет готово, поместите стеклянный шприц с запахом в держатель для лепки из пластилина и отрегулируйте его так, чтобы отверстие в широком конце было направлено прямо на пчел и 10 Е. Конец шприца должен находиться в одном-двух сантиметрах от того, чтобы пчела надежно разместила штуцер, соединяющий картридж с трубкой Airstream, и клапан системы над узким концом шприца.

В начале каждой попытки поместите запряженную пчелу на колышек в арене для кондиционирования так, чтобы ее антенны были направлены прямо на картридж с запахом. Дайте пчеле отдохнуть на арене от 15 до 25 секунд, прежде чем начать раздражитель запаха, чтобы она привыкла к новой обстановке. Нажмите кнопку запуска, чтобы запустить механизм синхронизации для подачи запаха.

Следите за реакцией пчелы на запах после появления раздражителя и до предъявления безусловного раздражителя. После каждой попытки дайте пчеле отдохнуть в зоне кондиционирования еще на 15-25 секунд, чтобы дать возможность сформировать первоначальную память. Слишком раннее перемещение пчелы после испытания значительно снизит эффективность каждого испытания кондиционирования.

Чтобы доставить сахарозу, держите кончик иглы в двух-трех сантиметрах от пчелы, пока присутствует запах. Используйте край тренировочной арены, чтобы предотвратить тряску шприца, так как это движение может отвлечь пчелу. Сигнал кормления будет звучать во время предъявления раздражителя запаха.

Как только прозвучит сигнал кормления, слегка прикоснитесь к усикам, пока пчела не вытянется в виде пробоут, после чего подкормите пчелу. Время между появлением запаха и появлением сахарозы имеет решающее значение. В идеале эти два стимула должны ненадолго накладываться друг на друга.

Если между появлением запаха и появлением сахарозы пройдет более нескольких секунд, эффективность кондиционирования снизится. После обусловливания используйте неусиленные тестовые испытания, чтобы оценить, насколько хорошо пчелы запоминают условную ассоциацию. Во-первых, установите видеокамеру на штатив над тренировочной зоной и сфокусируйте камеру на передней части головы пчелы, чтобы антенны и зонд были в четком фокусе.

Убедитесь, что небольшой светодиодный индикатор, указывающий на появление раздражителя запаха, находится в области позади пчелы и там, где он виден на видео, но не для пчелы. Это позволяет определить время появления и смещения запаха во время анализа. Для получения наиболее стабильных результатов используйте свежеприготовленные картриджи с запахом для тестирования после того, как все будет настроено.

Начните тестирование с представления запаха, как показано ранее. Начните запись за 20 секунд до появления запаха и продолжайте запись не менее 20 секунд после этого. После тестирования используйте программное обеспечение для редактирования видео, чтобы оценить реакцию каждой пчелы на условие на стимул.

Используйте двоичную систему оценки для оценки ответа на расширение psis, оценивая ответы как положительные или отрицательные. Оцените ответ В как положительный. Когда B. extensus psis выходит за линию, образованную соединением кончиков открытых жвал, дает положительный ответ только тогда, когда B выдвигает свой пробный буа после появления запаха, но до смещения запаха реакция В оценивается как отрицательная, когда не происходит расширения prob Bois во время испытания, или если Pro Bois удлиняется после смещения одоранта. Могут быть собраны и другие параметры, такие как задержка до расширения, а также количество и общая продолжительность ответов расширения на условие.

Стимул увеличивался при последующих попытках обусловливания. Реакции на новые тестовые запахи, которые отличались от стимула длиной углеродной цепи и/или положением углеродного углерода, уменьшались пропорционально степени различия между стимулом условия и новым тестовым запахом. Эти данные иллюстрируют вариабельность и успешное обусловливание между новыми исследователями.

Ответы на восьмеричную форму различались в зависимости от группы, проводящей тестирование. Во время тестовых испытаний запах, используемый в качестве стимула состояния, вызывал самую сильную реакцию. Когда в качестве стимула состояния использовался восьмеричный сигнал, реакция была сильнее во время тестирования по сравнению с метилциклоном, новым запахом.

Точно так же метилциклон вызывал более сильную реакцию, когда его использовали в качестве условного стимула. Когда использовалось обратное спаривание, условная реакция снижалась почти до уровня, близкого к уровню нового запаха, что иллюстрирует важность точного времени для успешного обусловливания после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению нейронных основ обучения и памяти, а также к моделированию насекомых-организмов, таких как медоносная пчела.

Не забывайте, что работа с насекомыми, особенно с медоносными пчелами, может быть опасной. Убедитесь, что вы носите соответствующее защитное снаряжение при работе с этими животными.