Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты Дрозофилы Семенники

Общая цель этой процедуры заключается в препарировании и подготовке яичек к микроскопии. Это достигается путем предварительного рассечения пар семенников из брюшка самцов мух. Второй шаг заключается в том, чтобы разорвать яички на соответствующем уровне развития и раздавить яички, чтобы высвободить клетки внутри.

Затем раздавленные яички фиксируются, а затем инкубируются в первичных и вторичных антителах. Заключительным этапом является крепление ткани на предметное стекло для визуализации. В конечном счете, фазовый контраст или иммунофлуоресцентная микроскопия используется для наблюдения за клетками на различных стадиях сперматогенеза на предмет дефектов и морфологии, а также для наблюдения за субклеточными локализациями различных белков.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как определение критической роли белков во время прогрессирования сперматогенеза. Визуальная демонстрация вскрытия яичек с РА имеет решающее значение, потому что новичок в этой процедуре может первоначально испытывать трудности с обнаружением яичек в брюшной полости мухи. Кроме того, его легче продемонстрировать, чем описать словами наиболее успешный способ выполнения сдавливания ткани.

Чтобы начать вскрытие, обезболите мух в бутылке или флаконе с помощью струи углекислого газа. Затем перенесите обезболенных мух на площадку для мух. Сортируйте мух под препарирующим микроскопом с помощью небольшой кисти, чтобы собрать примерно шесть-восемь самцов желаемого генотипа.

Далее с каждой ширинки щипцами удалите крылья. Это предотвратит плавание мух в жидкости. Во время вскрытия добавьте 500 микролитров фосфатно-солевого буфера или PBS в одной капле на чашку для препарирования с силиконовым покрытием на черном фоне.

Затем направьте щипцы к переднему концу одной из крылатых мух. Возьмитесь за грудную клетку и погрузите в каплю PBS. Определите темно-коричневую структуру, расположенную на заднем конце брюшной полости, и с помощью другой пары щипцов захватите и оттяните наружные половые органы кзади, пока они не отделятся от брюшной полости.

В большинстве случаев яички, семенные пузырьки и добавочная железа удаляются из брюшной полости вместе с наружными половыми органами. Однако, если их нет, вставьте пару щипцов в брюшную полость и вытащите яички. Отделите яички от добавочных желез и наружных половых органов с помощью двух пар щипцов.

Отличают семенники дикого типа от соседних белых тканей по их желтому цвету. Чтобы подготовить образец к визуализации в реальном времени, с помощью пары щипцов аккуратно поместите две-три пары яичек в каплю PBS объемом четыре-пять микролитров на квадратную стеклянную крышку. Далее порвать.

Откройте каждый яичок с помощью пары щипцов в соответствующем горизонтальном положении, чтобы максимально увеличить присутствие желаемых типов клеток зародышевой линии в препарате. Содержимое яичек выйдет из разорванной области на предметное стекло. На этапе раздавливания для обогащения сперматогониями и сперматоцитами разрывают яички, прилегающие к его апикальному кончику, для обогащения.

Для сперматоцитов и сперматид разрывайте яички в положении слегка базально до первого уровня, чтобы обогатить более зрелые клетки зародышевой линии. Разорвите семенники ближе к тому месту, где начинается искривление. Следующим шагом является раздавливание яичек, аккуратно поместив предметное стекло микроскопа на защитное стекло.

Не прикладывайте давление вручную и избегайте улавливания пузырьков воздуха. Используйте образец в течение 15 минут после подготовки для наблюдения за живыми клетками. С помощью фазово-контрастной микроскопии аккуратно выведите излишки жидкости из-под покровного стекла с помощью чистящей салфетки, чтобы препарат размялся до тех пор, пока половые клетки не окажутся в четком фокусе.

Заморозьте подготовленные слайды, содержащие семенники тыквы, погрузив их с помощью пары металлических щипцов в жидкий азот до тех пор, пока жидкость не перестанет пузыриться. Немедленно снимите крышку лезвием бритвы. Затем переложите предметные стекла с металлическими щипцами на предварительно охлажденную стеклянную решетку для предметных стекол, заполненную ледяным 95% этанолом, и храните образец при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Перенесите уравновешенные предметные стекла на решетку для стеклянных стекол, наполненную 4% формальдегида в PBS плюс 0,1% Triton X 100 или PBST, и храните при комнатной температуре в течение семи минут. Затем перенесите слайды на стойку, заполненную PBS. Промойте предметные стекла в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, выбросив раствор в штативе и заменив его свежим раствором PBS.

Повторите стирку один раз. Выбросьте PBS и погрузите предметные стекла в PBST на 30 минут при комнатной температуре, чтобы проникнуть в клеточные мембраны. Затем трижды промойте слайды в PBS в течение пяти минут При комнатной температуре нарисуйте круг вокруг ткани кабачка на предметном стекле с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы удерживать растворы антител и поддерживать влажность ткани все время при выполнении иммуноокрашивания.

Затем добавьте от 30 до 40 микролитров первичного антитела, разведенного в PBST, в ткань внутри круга. Инкубируйте предметное стекло во влажной темной камере в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия после инкубации в первичном антителе. Промойте слайды три раза в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем добавьте от 30 до 40 микролитров пола, четыре конъюгированных вторичных антитела, разведенных в PBS, в ткань и инкубируйте в темноте в течение одного-двух часов при комнатной температуре. Далее трижды промойте горки в ПБС в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте от 30 до 40 микролитров раствора в ткань внутри круга.

Аккуратно наденьте на салфетку стеклянную крышку, соблюдая особую осторожность, чтобы не задержать пузырьки воздуха. При появлении пузырьков воздуха осторожно перемещайте крышку, скользите, не разрушая образец, пока пузырьки не выйдут со стенок крышки. Промокните излишки салфетки с краев горки чистящей салфеткой.

Затем запечатайте покровное стекло с помощью лака для ногтей, просмотрите иммуно окрашенные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа в течение трех-четырех часов. На этом мультфильме изображено расположение различных уровней созревания клеток в семенниках дрозофилы. Первый уровень содержит более молодые клетки, которые находятся на ранних стадиях сперматогенеза, а третий уровень содержит более зрелые сперматозоиды.

Второй уровень содержит смешанную популяцию миотических и постмиотических клеток зародышевой линии. Соответствующее фазово-контрастное изображение показывает высвобождение сперматогонии и ранних и поздних первичных сперматоцитов при разрыве яичек на первом уровне. Желтая стрелка также указывает на слияние двух или более взаимосвязанных клеток в результате неполного цитокинеза.

Артефактом показанной здесь процедуры сдавливания является соответствующее фазово-контрастное изображение, показывающее высвобождение поздних первичных сперматоцитов и постмиотических клеток, включая круглые сперматиды, удлиняющиеся сперматиды и зрелые сперматозоиды при разрыве яичек на втором уровне. Фазово-контрастная визуализация семенников кабачка также может быть использована для легкой идентификации дефектов в обильном круге. Здесь показаны сперматиды дикого типа с однофазным светлым ядром, прикрепленные к фазовому одиночному митохондриальному агрегату примерно одинакового размера.

Напротив, сперматиды из яичек Ауна содержат несколько маленьких ядер и один большой митохондриальный агрегат в результате неудачного цитокинеза и ошибок в сегрегации хромосом. Показанные здесь изображения в оттенках серого относятся к препарату яичек тыквы, окрашенных реагентами, которые идентифицируют микротрубочки, ДНК и центросомы по цвету. Объединенные изображения показывают делящийся сперматоцит, большое поле круглых сперматид и пучок зрелых сперматозоидов

Подготовка образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии может быть выполнена за шесть часов при правильном выполнении. В дополнение к обработке офт яичек для микроскопии, препарированные яички могут быть использованы в качестве альтернативы для биохимического анализа белков.