Name: Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты Дрозофилы Семенники (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Узнайте методы цитологического анализа сперматогенеза у Drosophila с помощью живых и фиксированных препаратов семенников. Этот подход позволяет исследовать дефекты развития клеток и локализацию белков.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Андерсона для установления в лаборатории Ли эти принятые методы изучения сперматогенез с экспертным советом из Карен Хейлзом. Х. Ода и Y. Акияма-Ода любезно предоставили γ-тубулина-GFP летать запас. Эта работа была поддержана грантом NIH R01 в LAL (GM074044).

1. Семенники Рассечение <ol><li> Обезболить мух в бутылку или флакон с помощью потока СО 2 и трансфер в лету площадку. </li><li> Сортировать летает под микроскопом рассекает используя маленькую кисть, и собрать соответствующее количество (в зависимости от эксперимента) от дрозофилы самцов желаемых генотипов. Молодые самцы (0-2 дней) идеально подходят для изучения клеток по всему ранних стадиях сперматогенеза (например сперматогенов, сперматоциты, и в начале пост-мейотические сперматид), в то время как немного старшего мужчины (2-5 дней) идеально подходят для изучения клеток в завершающей стадии сперматогенеза (в частности, созревают сперматозоиды). </li><li> С помощью щипцов для удаления крыльев друг от летать (чтобы предотвратить мух от плавающих в жидкости при вскрытии). </li><li> Добавить ~ 500 мл фосфатно-солевом буфере (130 мМ NaCl, 7 мМ Na 2 HPO 4, 3 мМ NaH 2 PO 4; PBS) в капле к силиконовым покрытием рассечение блюдо начерный фон. Другие водные растворы были успешно использованы для яичек вскрытия 3. </li><li> Точка щипцы к передней части лету, понять его грудной клетки, и погрузите его в капле PBS. При просмотре через вскрытии микроскопом, использовать другую пару щипцов для тяните наружных половых органов (темно-коричневый, расположенный на заднем конце вентральной брюшной полости) кзади, пока она не отделяется от живота. В большинстве случаев, яички, семенные пузырьки и аксессуары железы будет удалена из брюшной полости вместе с наружных половых органов, а если нет, вставить одну пару щипцов в брюшную полость и дразнить яички. </li><li> Отдельные яички из аксессуаров железы и наружных половых органов с помощью двух пар щипцов в капле PBS (рис. 2). Семенники дикого типа легко отличить от соседних белых тканей их желтого цвета. Немедленно приступить к шагу 2. </li><li> Для выделения яички от pharate мужчин (I.. Э заключен в куколки случае), дополнительный шаг первым должен быть выполнен, что включает в себя удаление муху из куколки случае; этот шаг был описан ранее в другом месте 31. Продолжайте вскрытия, как и для взрослых семенников, начиная с шага 1.2. </li><li> Для выделения яички от личинок самцов, выполнить модификацию протокола для изоляции дрозофилы личинок яичников 32. Вкратце, мужской личинки можно отличить от женского личинок наличием пары крупными, овальными структур (личинки яичек), встроенных в задней трети жира тела. Для выделения личинок яички, частично содрать открыть мужской личинку, чтобы изолировать семенники и окружающий жира тела из брюшной полости, как описано для выделения личинок яичников. Немедленно перейти к шагу 2 протокола, описанного здесь, яички позже могут быть удалены из жирового тела непосредственно перед монтажом (шаги 2,3 или 3,14), как описано в яичниках 32. </li></ol><ol><li> Используйте пару щипцов осторожно положите 2-3 пары семенников в капле 4-5 мл PBS на квадратной покровным стеклом. Отметим, что отношение числа яичек в объеме PBS может нуждаться в корректировке: слишком много жидкости будет предотвратить клетки от распространения должным образом, когда сжато, в то время как слишком мало жидкости вызовет клетки лопнуть, когда раздавленный. Дополнительно: Использование силиконизированный крышка скользит минимизировать приверженность ткани для покрытия скольжение в п. 3.2. </li><li> Используйте пару щипцов, чтобы разорвать каждого яичка в соответствующем положении так, чтобы максимизировать присутствие желательных типов зародышевой линии клеток в подготовке (обратите внимание, что содержимое яичка будет в основном выход из разорванной области на слайде во время деформируя шаг.) Для обогащения для сперматогониев и сперматоцитах, рвать открыть яичка, прилегающей к вершинной наконечником (уровень 1, рис. 2В). Для обогащения для сперматоцитах и ​​сперматид, слезоточивый открыть яичка в позition слегка базальная до уровня 1 (уровень 2, рис. 2В). Для обогащения для более зрелых половых клетках, оторвать открытый яичко ближе туда, где кривизна начинается (уровень 3, рис. 2б). </li><li> Аккуратно поместите предметное стекло микроскопа над покровным раздавить яички; не оказывать давление вручную, так как вес одной только покровным достаточно для получения правильно сжатую образец. Старайтесь избегать образования пузырьков. Дополнительно: Использование поли-L-лизин покрытием предметные стекла способствовать присоединению ткани скользить в шаге 3.2. </li><li> Немедленно Используйте подготовку (в идеале в течение 15 мин подготовки), чтобы наблюдать живые клетки на фазово-контрастной микроскопии; для трансгенных мух с выражением флуоресцентно меченых белков в яичках, живые клетки могут быть рассмотрены с помощью флуоресцентной микроскопии на этом шаге. С другой стороны, продолжить фиксации и окрашивания антител (протокол 3). </li><li> Аккуратно фитиль лишнюю жидкость из-под покровного стекла с использованием очистки жIPE чтобы уплощение подготовки до зародышевые клетки не будут ясно в фокусе. </li></ol> 3. Формальдегид Фиксация и антител Окрашивание <ol><li> Привязать заморозить каждый слайд, содержащий раздавленные яички (от протокола 2) с помощью пары металлических щипцов, чтобы погрузить его кратко в жидком азоте (до жидкого азота не остановится пузырьков). </li><li> Снимите покровное немедленно используя лезвие бритвы. </li><li> Использование металлических щипцов для передачи слайды в prechilled стекло стойки, заполненной ледяной 95% этанола (спектрофотометрический класса, свободный от метанола). Хранить при -20 ° С в течение 10 мин. </li><li> Использование металлических щипцов для передачи слайды предметное стекло стойки, заполненной 4% формальдегидом в PBS плюс 0,1% Тритон Х-100 (PBS-T). Хранить при комнатной температуре в течение 7 мин. </li><li> Используйте металлические щипцы, чтобы передать слайды предметное стекло стойки, заполненной PBS. Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите 1x. Выполните все моет путем отбрасывания решение в стекло стойки ( <em&gt; Т.е.. путем заливки его) и замена свежим раствором. </li><li> Отменить PBS и погружают слайдов в PBS-T в течение 30 мин при комнатной температуре к проницаемыми клеточные мембраны. </li><li> Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите 2 раза. </li><li> Шаг (не обязательно) Блокировка: Погрузитесь слайдов в PBS плюс 1% BSA в течение 45 мин при комнатной температуре. </li><li> Используйте гидрофобный барьер перо, чтобы нарисовать круг на слайде вокруг раздавленной ткани (легко видимой на глаз), чтобы ограничить решения антител (добавлены с шагом 3,9 и 3,11). Ткань должна быть влажной все время при выполнении иммуноокрашивания. </li><li> Добавить 30-40 мл первичного антитела (разбавленный в PBS-T, 1:400 до 1:50 в зависимости от антитела) в ткани внутри круга. Если блокирования проводили, развести первичного антитела в PBS-T плюс 1% BSA. Анти-гамма-тубулина антитела (для окрашивания центросомах на рисунке 4) разбавляли 1:100. Выдержите во влажной, темной камере (закрытый пластиковой коробке например.с влажных бумажных полотенец) в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. </li><li> Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при 3x комнатной температуры. Если блокирование была выполнена, мыть дважды в PBS-T и один раз в PBS (5 мин при комнатной температуре каждого). </li><li> Добавить 30-40 мл флуорофора, конъюгированным вторичным антителом (разбавленного 1:400 в PBS) в ткани и инкубируют в темноте в течение 1-2 часов при комнатной температуре. </li><li> Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите 2 раза. </li><li> Добавить 30-40 мл раствора DAPI (0,2 мг / мл в PBS) в ткани в окружности. </li><li> Аккуратно поместите покровным стеклом над ткани, избегая образования пузырьков. Если пузырьки воздуха должны появиться, тщательно передвигаться по покровным не разрушая сквош пока пузырьки вырваться из сторон покровным. </li><li> Используйте протирайте чтобы уничтожить излишки DAPI от краев слайда. </li><li> Закройте крышку скольжения на слайд с использованием четких лак для ногтей. </li><li> Используйте этот препаратв течение следующих 3-4 часов, чтобы просмотреть, иммуноокрашиванию клетки флуоресцентной микроскопии. Для более длительного хранения слайдов (до, по крайней мере нескольких недель), используйте на основе глицерина трудно смонтировать носитель с DAPI и хранить слайды при -20 ˚ C. </li><li> С другой стороны, закрепить образцы в метаноле вместо формальдегида (в зависимости от антигена). После завершения всего протокол через шаг 3.2, погрузиться слайды раздавленных яичек в метаноле в течение 10 мин при -20 ° С и перейдите к шагу 3.5 и далее. </li></ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Хотя яички мух дикого типа могут быть легко идентифицированы за счет их желтого цвета (в отличие соседних белых тканей), яички белых мутантных мух белые и таким образом может иногда путать с кишечнике. Большинство трансгенных линий, которые обычно в белом фоне, также есть белые яички, потому что мини-белый ген найден в P-элементов не способствуют накоплению пигмента в яичках. Когда Drosophila яички нельзя отличить по цвету, другие легко узнаваемые черты включают их спиральный...

Drosophila яички являются идеальным модельной системой для изучения многих биологических процессов, включая регуляцию стволовых клеток, мейоза и развития сперматозоидов 13-18. В сперматоциты и их мейотические шпиндели большие и, следовательно, удобным для цитологического анализа и расслабленной контрольно-пропускные пункты клеточного цикла во время сперматогенеза облегчить изучение мутаций в генов клеточного цикла. Различные типы клеток можно наблюдать в упорядоченной прогрессии по длине яичек, и любое нарушение сперматогенеза может привести к изменениям в этой общей договоренности. Эти характеристики в сочетании с Drosophila генетических инструментов способствовали мутационный анализ сперматогенеза 21-23. Этапы Drosophila сперматогенеза были четко определены. Клетках зародышевой линии, которые развиваются синхронно в кисты прогрессировать последовательно через стадии сперматогенеза по длине яичка. Во время бого митотического и мейотических подразделений мужских половых клеток, цитокинез происходит не полностью, так что дочерние клетки остаются соединены цитоплазматическими мостиками, известных как кольцевых каналов (рис. 1). Верхушечный верхушка яичка содержит население зародышевой линии стволовых клеток, который дает начало сперматогониальных клеток, которые подвергаются четыре митотических делений с неполной цитокинезе генерировать 16-клеточные кисты первичных сперматоцитах. После премейотической S фазе, сперматоциты введите G2, длительный период роста ~ 90 час, в течение которого увеличивается сотовой объем ~ 25 раз. Прогрессирование через мейоза I и мейоз II приводит к образованию 32-клеточных кист средних сперматоцитах и ​​64-клеточных кист гаплоидных сперматидах, соответственно. Незрелые, круглые сперматиды проходят обширные сотовой ремоделирования сформировать зрелые сперматозоиды. После мейоза клетки, в частности пучки удлинения и зрелые сперматиды, занимают большую часть объема яичка. Тон успешно транспорт функциональной спермы в женских мух требует координации между различными частями мужской репродуктивной системы, которая состоит из нескольких парных структур (яичек, семенных пузырьков, и придаточных желез) и одной эякуляции протока (рис. 2). Сперматозоиды производятся в яичках и хранятся в семенных пузырьков, пока совокупления 24. Акцессорные железы содержат секреторные клетки, которые производят семенной жидкости. Сперма миграции из семенных пузырьков смешиваются с семенной жидкости внутри эякуляции канал, который соединен с обеих семенных пузырьков и придаточных желез. Эта смесь спермы и семенной жидкости, в конечном счете откачивают из самца во влагалище самки летать через эякуляции лампы, расположенной на заднем конце охватываемой части живота 25. Белки в пределах семенной жидкости имеют важное значение для длительного хранения спермы в специализированных органов, известных как сперматеки в респroductive тракт Drosophila женщин 26. Отличные методы изоляции дрозофилы яичек и визуализации клеток на разных стадиях сперматогенеза доступны в научной литературе 3-12. Здесь мы добавить к этому совокупность знаний, представляя примеры этих протоколов с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для подготовки проб живые яичек для фазово-контрастной микроскопии основан на описанным ранее методом 27. Протокол формальдегида фиксации и иммунным окрашиванием семенников также основано на ранее описанного метода 28. Подходы, описанные здесь, были использованы во многих исследованиях Drosophila сперматогенеза (например, для оценки роли динеина, микротрубочек двигатель минус-конец-направленный, в течение Drosophila сперматогенеза). В дополнение к основным протоколов, предложения предусмотрены для varyinг рассечение с целью обогащения для сперматогониев, сперматоцитах или зрелой спермы. Различные методы обработки яички такие, что кисты либо остаются нетронутыми или нарушается по мере необходимости описаны. Преимущество использования Drosophila яички в качестве модельной системы является то, что, по сравнению с Drosophila ооцитов и эмбрионов, антитела и красители могут легко проникают в клетки после их разгона от семенников, и незначительное промывание требуется, таким образом, протоколы могут быть выполнены в относительно короткое время.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Двухкомпонентный силиконовый эластомер для изготовления силиконовой чашки для препарирования из чашки Kimax Petri</td></tr><tr><td>PAP ручка</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Прозрачный защитный крем для ногтей</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Мышиное антитело к гамма-тубулину (клон GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure козье антимышиное антитело IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Этанол</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Метанол</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% формальдегид</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Использовать в соответствии с инструкцией производителя для силиконизации покровных чеков</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 мг/мл в 75% этаноле; хранить при температуре -20°С; С</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ресерч Продактс Интернэшнл Корп.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes деликатные салфетки</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Класс молекулярной биологии</td></tr><tr><td>Стеклянная банка для окрашивания Coplin, завинчивающаяся крышка</td><td>Электронная микроскопия Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Предметные стекла для одиночного матового микроскопа</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Предметные стекла для микроскопа с поли-L-лизиновым покрытием</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Опционально (для замены необработанных предметных стекол микроскопа)</td></tr><tr><td>Квадратное защитное стекло</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Лезвия бритвы</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax чашка Петри</td><td>Fisher</td><td>Scientific S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Щипцы</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Pattern 5 INOX</td></tr><tr><td>Стереоскоп</td> <td>Stemi 2000-CSCarl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X объектив</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X объектив</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Семенники

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Дрозофилы является мощным модель системы, которая широко используется для выяснения различных биологических процессов. Например, исследования обоих женского и мужских половых линий дрозофилы внесли большой вклад в современное понимание мейоза, а также биологии стволовых клеток. Отлично протоколы доступны в литературе для выделения и визуализации Drosophila яичников и яичек 3-12. При этом методы вскрытия и подготовки дрозофилы яичек для микроскопического анализа описаны с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для выделения семенников из брюшной полости взрослых мужчин и подготовки слайды живой ткани для анализа с помощью фазово-контрастной микроскопии, а в качестве протокола для фиксации и иммунного окрашивания яички для анализа с помощью флуоресцентной микроскопии представлены. Эти методы могут быть применены в характеристике Drosophila мутантов, которые обладают Dвидеоэффекты в сперматогенеза, а также в визуализации внутриклеточных локализаций белков.

Пример правильно расчлененного пары дрозофилы мужских половых органов показано на рисунке 2А. Семенники удалены из брюшной полости взрослого мужского лету, как правило, прилагается к эякуляции протока (коричневый, рис. 2А &quot;) и парой придаточных желез (зеленый, рис. 2А &#39;) через пару семенных пузырьков (синий, рисунок 2А&quot;) . Чтобы отделить яички от большинства сопроводительном соматических тканей, в эякуляции протока и придаточных ж...

Способы выделения и подготовки дрозофилы яичек образцов (жить и фиксированной) для работы с изображениями на фазе контраста и флуоресцентной микроскопии описаны здесь.

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Общая цель данной процедуры заключается в препарировании и подготовке семенников дрозофил для микроскопии. Сначала из брюшка самцов мух извлекают пары семенников. На втором этапе семенники на соответствующей стадии развития разрывают и раздавливают для высвобождения находящихся внутри клеток.Затем раздавленные семенники фиксируют и инкубируют с первичными и вторичными антителами. Заключительным этапом является нанесение ткани на предметное стекло для визуализации. В итоге для анализа дефектов и морфологии клеток на различных стадиях сперматогенеза, а также для изучения субклеточной локализации различных белков используют фазово-контрастную или иммунофлуоресцентную микроскопию.Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как определение критических функций белков в процессе сперматогенеза. Визуальная демонстрация препарирования семенников RAs имеет решающее значение, так как новичку может быть initially сложно обнаружить семенники в брюшке мухи. Кроме того, наиболее эффективный способ раздавливания ткани проще продемонстрировать, чем описать словами.Для начала диссекции анестезируйте мух в бутыли или флаконе, используя поток углекислого газа. Затем перенесите анестезированных мух на планшет для работы с мухами. Отсортируйте мух под диссекционным микроскопом с помощью маленькой кисточки, чтобы отобрать примерно от шести до восьми самцов oph желаемого генотипа.Затем с помощью пинцета удалите крылья у каждой мухи. Это предотвратит всплывание мух на поверхность жидкости. Во время диссекции нанесите одну каплю фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) объемом 500 µL на силиконизированное блюдце для диссекции на черном фоне.Затем направьте пинцет к переднему концу одной из мух с удаленными крыльями. Захватите насекомое за грудной отдел и погрузите в каплю PBS. Найдите темно-коричневую структуру, расположенную на заднем конце вентральной стороны брюшка, и с помощью другого пинцета захватите и потяните наружные половые органы в заднем направлении до их отделения от брюшка.В большинстве случаев семенники, семенные пузырьки и вспомогательная железа удаляются из брюшной полости вместе с наружными половыми органами. Если же этого не произошло, введите пинцетом в брюшную полость и аккуратно извлеките семенники. Отделите семенники от вспомогательных желез и наружных половых органов, используя два пинцета.Отличите семенники дикого типа от соседних белых тканей по их желтому цвету. Чтобы подготовить образец для прижизненной визуализации, с помощью пинцета осторожно поместите две-три пары семенников в каплю PBS объемом 4–5 µL на квадратный предметное стекло. Затем разорвите.Разкройте каждое семенное яичко с помощью пинцета на соответствующем уровне, чтобы максимально увеличить количество искомых типов клеток зародышевого ряда в препарате. Содержимое семенников выйдет из места разрыва на предметное стекло. Для обогащения препарата сперматогониями и сперматоцитами на этапе раздавливания производите разрыв семенника в области, прилегающей к его апикальному концу.Для получения сперматоцитов и сперматид разрежьте семенники в области чуть ниже первого уровня, чтобы увеличить содержание более зрелых клеток зародышевого пути. Разорвите ткани семенников ближе к началу изгиба. Следующим шагом является раздавливание семенников путем осторожного наложения предметного стекла поверх покровного стекла.Не оказывайте давление вручную и избегайте образования пузырьков воздуха. Используйте образец в течение 15 минут после приготовления для наблюдения за живыми клетками. При использовании фазово-контрастной микроскопии аккуратно удалите излишки жидкости из-под покровного стекла с помощью безворсовой салфетки, чтобы препарат расправился и половые клетки стали четко видны в фокусе.Быстро заморозьте подготовленные предметные стекла с препаратами семенников методом раздавливания, погрузив их металлическим пинцетом в жидкий азот до прекращения пузырения жидкости. Сразу же удалите покровное стекло с помощью лезвия бритвы. Затем с помощью металлического пинцета перенесите стекла в предварительно охлажденную стеклянную кассету, заполненную ледяным 95%этанолом, и выдержите образец при температуре минус 20 °C в течение 10 минут.Перенесите уравновешенные стекла в штатив для предметных стекол, заполненный 4% формальдегидом в PBS с добавлением 0,1% Triton X 100 или PBST, и выдержите при комнатной температуре в течение семи минут. Затем перенесите стекла в штатив с PBS. Промойте стекла в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, сливая раствор из штатива и заменяя его свежим раствором PBS.Повторите промывку один раз. Слейте PBS и погрузите предметные стекла в PBST на 30 минут при комнатной температуре для пермеабилизации клеточных мембран. Затем промойте стекла в PBS трижды по пять минут при комнатной температуре. Обведите раздавленную ткань на стекле гидрофобным барьерным маркером, чтобы ограничить область нанесения растворов антител и поддерживать ткань постоянно увлажненной в процессе иммуноокрашивания.Затем добавьте от 30 до 40 µL первичных антител, разведенных в PBST, на ткань внутри круга. Инкубируйте предметное стекло во влажной темной камере в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C после инкубации с первичными антителами. Промойте предметные стекла трижды в PBS по пять минут при комнатной температуре.Затем добавьте к ткани от 30 до 40 µL конъюгированных вторичных антител, разведенных в PBS, и инкубируйте в темноте от одного до двух часов при комнатной температуре. Далее трижды промойте стекла в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте от 30 до 40 µL раствора DAPI к ткани внутри круга.Осторожно накройте ткань покровным стеклом, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Если появились пузырьки воздуха, аккуратно перемещайте покровное стекло, не повреждая образец, пока пузырьки не выйдут по краям стекла. Промокните излишки жидкости по краям предметного стекла с помощью очищающей салфетки.Затем закрепите покровное стекло с помощью лака для ногтей и изучите иммуноокрашенные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа через три-четыре часа. На этой схеме показано расположение различных стадий созревания клеток в семенниках drosophila. Первый уровень содержит более молодые клетки на ранних стадиях сперматогенеза, а третий уровень содержит более зрелые сперматозоиды.Уровень два содержит смешанную популяцию миотических и постмиотических клеток зародышевого пути. Соответствующее изображение в фазовом контрасте демонстрирует выход сперматогоний, а также ранних и поздних первичных сперматоцитов при разрыве семенника на уровне один. Желтая стрелка также указывает на слияние двух или более взаимосвязанных клеток вследствие неполного цитокинеза.Артефактом процедуры раздавливания, показанной здесь, является соответствующее фазово-контрастное изображение, демонстрирующее выход поздних первичных сперматоцитов и постмейотических клеток, включая круглые сперматиды, удлиняющиеся сперматиды и зрелые сперматозоиды, когда семенник был разорван на втором уровне. Фазово-контрастная микроскопия раздавленных семенников также может быть использована для быстрого выявления дефектов в многочисленных круглых сперматидах; здесь показаны сперматиды дикого типа с одним фазово-светлым ядром, присоединенным к фазово-темному одиночному митохондриальному агрегату примерно такого же размера.Напротив, сперматиды из семенников Aun содержат несколько маленьких ядер и один большой митохондриальный агрегат вследствие нарушения цитокинеза и ошибок при сегрегации хромосом. Представленные здесь изображения в градациях серого получены из препарата семенников, приготовленного методом раздавливания и окрашенного реагентами, которые позволяют цветно идентифицировать микротрубочки, ДНК и центросомы. На комбинированных изображениях видны делящийся сперматоцит, обширное поле круглых сперматид и пучок зрелых сперматозоидов. После освоения методики подготовки образцов фазово-контрастная микроскопия может быть выполнена за 20–30 минут.При правильном подходе подготовка образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии может занять шесть часов. Помимо обработки семенников oph для микроскопии, выделенные семенники могут быть альтернативно использованы для биохимического анализа белков.

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Визуализация центросомных белков Drosophila во время сперматогенеза является мощным методом для идентификации новых белков критических для центросом биологии, а также для выяснения конкретной функции известных игроков в этом процессе.

Визуализации Центросомы в Fly семенников

Иммуноокрашивание - это эффективный метод визуализации конкретных типов клеток и белков в тканях. Используя ультразвуковую обработку, описанный здесь протокол устраняет необходимость препарирования тканей Drosophila melanogaster из эмбрионов и личинок поздней стадии перед иммуноокрашиванием. Мы предлагаем эффективную методологию иммуноокрашивания цельных личинок с фиксацией формальдегида.

Озвучивание при содействии Иммунофлуоресцентное Окрашивание поздней стадии эмбрионального и личиночного<em&gt; Drosophila</em&gt; Ткани<em&gt; На месте</em

Этот протокол описывает вскрытие и культивирование интактных яичек и кист зародышевой линии из куколок Drosophila melanogaster. Этот метод позволяет проводить микроскопическое наблюдение за сперматогенезом ex vivo. Кроме того, мы описываем фармакологический анализ влияния ингибиторов на определенные стадии развития герминогенных клеток в яичках куколки.

Экс естественных Культура Drosophila куколки яичка и одного мужчины зародышевой линии кисты: Вскрытие, Imaging, и фармакологическому лечению

Мы представляем протоколы сбора, подготовки и визуализации зрелых ооцитов дрозофилы. Эти методы позволяют визуализировать поведение хромосом, сборку и функционирование веретена во время мейоза.

Методы для работы с изображениями прометафазе и метафазе мейоза I в фиксированных<em&gt; Drosophila</em&gt; ооциты

Цель этой техники Сквош трубочку является быстро оценить цитологические особенности развивающихся сперматоцитах мыши при сохранении целостности клеточных. Этот метод позволяет для изучения всех этапов сперматогенеза и могут быть легко реализованы вместе с другими биохимических и молекулярных биологических подходов для изучения мыши мейоз.

Семенных канальцах Сквош техника для цитологического анализа с помощью мыши модель сперматогенеза

Целью этого протокола является анализ деления клеток в нетронутой ткани живой и фиксированной клеточной микроскопией с использованием дрозофилы мейотических сперматозитов. Протокол демонстрирует, как изолировать целые, нетронутые яички от личинок Дрозофилы и ранних куколок, и как обрабатывать и монтировать их для микроскопии.

Подготовка Drosophila Ларваль и Pupal Тесты для анализа клеточного отдела в прямом эфире, Intact Ткани

Здесь мы представляем улучшенный протокол для получения и иммуноокрашивания яичек Drosophila, подходящий для конфокальной микроскопии, а также позволяющий воспроизводимую и надежную маркировку. Мы иллюстрируем этот протокол 3D-представлением и количественной оценкой экспериментов по колокализации на больших сперматозоидах S4-S5.

Иммуноокрашивание яичек дрозофилы цельной горы для 3D конфокального анализа крупных сперматоцитов

Здесь представлен протокол микроинъекционного и одновременного изображения нескольких эмбрионов дрозофилы во время эмбрионального развития с использованием изображения на основе пластин с высоким содержанием.

Дрозофила Эмбрион Подготовка и микроинъекция для live Cell Микроскопия Выполняется с помощью автоматизированного анализа высокого содержания

Здесь мы представляем простой и эффективный метод изоляции живых мейотических и постмейотических зародышевых клеток от взрослых мышей. Используя низкоцитотоксичность, фиолетовый возбужденный краситель связывания ДНК и флуоресценцию активированной сортировки клеток, можно изолировать высокообогащеные популяции сперматозоидов для многих нисходящих приложений.

Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя

Здесь мы предоставляем протокол вскрытия, необходимый для живого изображения поздней эмбриональной мужской гонады дрозофилы . Этот протокол позволит наблюдать динамические клеточные процессы в нормальных условиях или после трансгенных или фармакологических манипуляций.

Вскрытие и живая визуализация поздней эмбриональной гонады дрозофилы

В этой статье сообщается о ингибировании CENP-E in vivo с помощью абдоминальной хирургии и инъекции яичек GSK923295, ценной модели для мужского мейотического деления. Используя анализы иммунофлуоресценции, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии, мы показываем, что ингибирование CENP-E приводит к смещению хромосом и нестабильности генома в сперматоцитах мышей.

Функциональная оценка кинезина-7 CENP-E в сперматоцитах с использованием ингибирования, иммунофлюоресценции и проточной цитометрии in vivo

Узнайте методы цитологического анализа сперматогенеза у Drosophila с помощью живых и фиксированных препаратов семенников. Этот подход позволяет исследовать дефекты развития клеток и локализацию белков.

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты

Больше видео