Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты
20 января 2014 г.
Способы выделения и подготовки дрозофилы яичек образцов (жить и фиксированной) для работы с изображениями на фазе контраста и флуоресцентной микроскопии описаны здесь.
Общая цель данной процедуры заключается в препарировании и подготовке семенников дрозофил для микроскопии. Сначала из брюшка самцов мух извлекают пары семенников. На втором этапе семенники на соответствующей стадии развития разрывают и раздавливают для высвобождения находящихся внутри клеток.
Затем раздавленные семенники фиксируют и инкубируют с первичными и вторичными антителами. Заключительным этапом является нанесение ткани на предметное стекло для визуализации. В итоге для анализа дефектов и морфологии клеток на различных стадиях сперматогенеза, а также для изучения субклеточной локализации различных белков используют фазово-контрастную или иммунофлуоресцентную микроскопию.
Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как определение критических функций белков в процессе сперматогенеза. Визуальная демонстрация препарирования семенников RAs имеет решающее значение, так как новичку может быть initially сложно обнаружить семенники в брюшке мухи. Кроме того, наиболее эффективный способ раздавливания ткани проще продемонстрировать, чем описать словами.
Для начала диссекции анестезируйте мух в бутыли или флаконе, используя поток углекислого газа. Затем перенесите анестезированных мух на планшет для работы с мухами. Отсортируйте мух под диссекционным микроскопом с помощью маленькой кисточки, чтобы отобрать примерно от шести до восьми самцов oph желаемого генотипа.
Затем с помощью пинцета удалите крылья у каждой мухи. Это предотвратит всплывание мух на поверхность жидкости. Во время диссекции нанесите одну каплю фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) объемом 500 µL на силиконизированное блюдце для диссекции на черном фоне.
Затем направьте пинцет к переднему концу одной из мух с удаленными крыльями. Захватите насекомое за грудной отдел и погрузите в каплю PBS. Найдите темно-коричневую структуру, расположенную на заднем конце вентральной стороны брюшка, и с помощью другого пинцета захватите и потяните наружные половые органы в заднем направлении до их отделения от брюшка.
В большинстве случаев семенники, семенные пузырьки и вспомогательная железа удаляются из брюшной полости вместе с наружными половыми органами. Если же этого не произошло, введите пинцетом в брюшную полость и аккуратно извлеките семенники. Отделите семенники от вспомогательных желез и наружных половых органов, используя два пинцета.
Отличите семенники дикого типа от соседних белых тканей по их желтому цвету. Чтобы подготовить образец для прижизненной визуализации, с помощью пинцета осторожно поместите две-три пары семенников в каплю PBS объемом 4–5 µL на квадратный предметное стекло. Затем разорвите.
Разкройте каждое семенное яичко с помощью пинцета на соответствующем уровне, чтобы максимально увеличить количество искомых типов клеток зародышевого ряда в препарате. Содержимое семенников выйдет из места разрыва на предметное стекло. Для обогащения препарата сперматогониями и сперматоцитами на этапе раздавливания производите разрыв семенника в области, прилегающей к его апикальному концу.
Для получения сперматоцитов и сперматид разрежьте семенники в области чуть ниже первого уровня, чтобы увеличить содержание более зрелых клеток зародышевого пути. Разорвите ткани семенников ближе к началу изгиба. Следующим шагом является раздавливание семенников путем осторожного наложения предметного стекла поверх покровного стекла.
Не оказывайте давление вручную и избегайте образования пузырьков воздуха. Используйте образец в течение 15 минут после приготовления для наблюдения за живыми клетками. При использовании фазово-контрастной микроскопии аккуратно удалите излишки жидкости из-под покровного стекла с помощью безворсовой салфетки, чтобы препарат расправился и половые клетки стали четко видны в фокусе.
Быстро заморозьте подготовленные предметные стекла с препаратами семенников методом раздавливания, погрузив их металлическим пинцетом в жидкий азот до прекращения пузырения жидкости. Сразу же удалите покровное стекло с помощью лезвия бритвы. Затем с помощью металлического пинцета перенесите стекла в предварительно охлажденную стеклянную кассету, заполненную ледяным 95%этанолом, и выдержите образец при температуре минус 20 °C в течение 10 минут.
Перенесите уравновешенные стекла в штатив для предметных стекол, заполненный 4% формальдегидом в PBS с добавлением 0,1% Triton X 100 или PBST, и выдержите при комнатной температуре в течение семи минут. Затем перенесите стекла в штатив с PBS. Промойте стекла в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре, сливая раствор из штатива и заменяя его свежим раствором PBS.
Повторите промывку один раз. Слейте PBS и погрузите предметные стекла в PBST на 30 минут при комнатной температуре для пермеабилизации клеточных мембран. Затем промойте стекла в PBS трижды по пять минут при комнатной температуре. Обведите раздавленную ткань на стекле гидрофобным барьерным маркером, чтобы ограничить область нанесения растворов антител и поддерживать ткань постоянно увлажненной в процессе иммуноокрашивания.
Затем добавьте от 30 до 40 µL первичных антител, разведенных в PBST, на ткань внутри круга. Инкубируйте предметное стекло во влажной темной камере в течение двух часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C после инкубации с первичными антителами. Промойте предметные стекла трижды в PBS по пять минут при комнатной температуре.
Затем добавьте к ткани от 30 до 40 µL конъюгированных вторичных антител, разведенных в PBS, и инкубируйте в темноте от одного до двух часов при комнатной температуре. Далее трижды промойте стекла в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте от 30 до 40 µL раствора DAPI к ткани внутри круга.
Осторожно накройте ткань покровным стеклом, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Если появились пузырьки воздуха, аккуратно перемещайте покровное стекло, не повреждая образец, пока пузырьки не выйдут по краям стекла. Промокните излишки жидкости по краям предметного стекла с помощью очищающей салфетки.
Затем закрепите покровное стекло с помощью лака для ногтей и изучите иммуноокрашенные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа через три-четыре часа. На этой схеме показано расположение различных стадий созревания клеток в семенниках drosophila. Первый уровень содержит более молодые клетки на ранних стадиях сперматогенеза, а третий уровень содержит более зрелые сперматозоиды.
Уровень два содержит смешанную популяцию миотических и постмиотических клеток зародышевого пути. Соответствующее изображение в фазовом контрасте демонстрирует выход сперматогоний, а также ранних и поздних первичных сперматоцитов при разрыве семенника на уровне один. Желтая стрелка также указывает на слияние двух или более взаимосвязанных клеток вследствие неполного цитокинеза.
Артефактом процедуры раздавливания, показанной здесь, является соответствующее фазово-контрастное изображение, демонстрирующее выход поздних первичных сперматоцитов и постмейотических клеток, включая круглые сперматиды, удлиняющиеся сперматиды и зрелые сперматозоиды, когда семенник был разорван на втором уровне. Фазово-контрастная микроскопия раздавленных семенников также может быть использована для быстрого выявления дефектов в многочисленных круглых сперматидах; здесь показаны сперматиды дикого типа с одним фазово-светлым ядром, присоединенным к фазово-темному одиночному митохондриальному агрегату примерно такого же размера.
Напротив, сперматиды из семенников Aun содержат несколько маленьких ядер и один большой митохондриальный агрегат вследствие нарушения цитокинеза и ошибок при сегрегации хромосом. Представленные здесь изображения в градациях серого получены из препарата семенников, приготовленного методом раздавливания и окрашенного реагентами, которые позволяют цветно идентифицировать микротрубочки, ДНК и центросомы. На комбинированных изображениях видны делящийся сперматоцит, обширное поле круглых сперматид и пучок зрелых сперматозоидов. После освоения методики подготовки образцов фазово-контрастная микроскопия может быть выполнена за 20–30 минут.
При правильном подходе подготовка образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии может занять шесть часов. Помимо обработки семенников oph для микроскопии, выделенные семенники могут быть альтернативно использованы для биохимического анализа белков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описываются методы выделения и подготовки образцов семенников Drosophila для микроскопии. Методы включают диссекцию, фиксацию и инкубацию с антителами для изучения клеточных структур.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Микроскопия
Теоретическая справка
- Drosophila служит модельным организмом в биологических исследованиях.
- Развитие семенников имеет решающее значение для понимания сперматогенеза.
- Методы микроскопии позволяют проводить детальное наблюдение за клетками.
- Иммунофлуоресценция позволяет определить локализацию белков.
Цель исследования
- Препарировать и подготовить семенники для микроскопии.
- Изучить клетки на различных стадиях сперматогенеза.
- Выявить дефекты и особенности морфологии развивающихся клеток.
Используемые методы
- Препарирование пар семенников самцов Drosophila.
- Разрыв и раздавливание семенников для высвобождения клеток.
- Фиксация раздавленных семенников для последующего анализа.
- Инкубация с первичными и вторичными антителами.
Основные результаты
- Успешная изоляция семенников для визуализации.
- Наблюдение за клеточными структурами на разных стадиях развития.
- Выявление дефектов сперматогенеза.
- Локализация белков внутри клеток.
Выводы
- Данные методы обеспечивают надежный способ подготовки семенников Drosophila для микроскопии.
- Полученные результаты способствуют пониманию процесса сперматогенеза.
- Эти методики могут быть применены для изучения других процессов развития.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный протокол позволяет детально визуализировать развитие клеток зародышевого слоя на генетически доступной модели, что способствует валидации мишеней в репродуктивной биологии и механистическим исследованиям деления клеток. Обеспечивая воспроизводимую подготовку семенников Drosophila для фазово-контрастной и иммунофлуоресцентной микроскопии, он облегчает фенотипический скрининг мутантов, влияющих на сперматогенез. Этот подход помогает снизить риски при выдвижении гипотез о функциях белков в ходе гаметогенеза посредством прямого наблюдения за субклеточной локализацией и дефектами развития.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации локализации белков на стадиях сперматогенеза.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения за клеточными фенотипами на мутантных фонах.
- Прогностическая ценность: помогает снизить механистические риски, связывая молекулярные нарушения с наблюдаемыми дефектами развития половых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: позволяет получать стандартизированные биологические образцы, подходящие для количественного скрининга генетических или химических пертурбаций с помощью методов визуализации.
- Воспроизводимость: обеспечивает единообразную подготовку раздавов семенников для получения надежных результатов при фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии в различных экспериментах.
- Масштабируемость: позволяет проводить параллельную обработку нескольких генотипов для сравнительного анализа дефектов сперматогенеза.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Представляет собой релевантную для изучения заболеваний систему для исследования консервативных механизмов мейоза и цитокинеза, применимую в исследованиях бесплодия.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты фундаментальных открытий на Drosophila с доклиническими моделями посредством консервативных путей сперматогенеза.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет проводить фенотипическую оценку на ранних этапах для приоритизации мишеней с измеримым влиянием на развитие.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в рабочие процессы ранних этапов разработки, обеспечивая проверку гипотез при валидации мишеней и получение количественных данных визуализации для идентификации ведущих соединений в путях репродуктивной биологии.
- Фундаментальная биология: Облегчает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей, позволяя визуализировать прогрессию и дефекты клеток зародышевого ряда.
- Скрининг: Обеспечивает получение готовых к анализу образцов с количественными данными для оценки генетических или фармакологических модификаторов сперматогенеза.
- Аналитика: Позволяет получать измеримые результаты визуализации (например, морфологию клеток, паттерны локализации) для сравнения различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований путем моделирования консервативных механизмов гаметогенеза.
- Повторное использование в рамках организации: Создает универсальную платформу для скрининга в области биологии развития, применимую к множеству линий мутантов или условий обработки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования роли мишеней за счет снижения неопределенности в механистических интерпретациях благодаря прямому цитологическому наблюдению.
- Практическая ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость подготовки образцов зародышевой линии в различных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Облегчает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя фенотипические доказательства для снижения рисков, связанных с мишенями, на ранних этапах поиска.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе наблюдаемых фенотипов развития в системе, совместимой с высокопроизводительным скринингом.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с Drosophila, проведения диссекции и методы микроскопии.
- Необходимы диссекционные микроскопы, системы флуоресцентной или фазово-контрастной визуализации, а также стандартные инструменты для гистологических исследований.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется стандартизация времени раздавливания, фиксации и инкубации с антителами для всех пользователей.
- При адаптации метода следует учитывать необходимость регулировки положения разрыва и силы давления при раздавливании в зависимости от целей обогащения определенными типами клеток зародышевого пути.
- Практические ограничения включают хрупкость тканей при раздавливании и необходимость проведения визуализации живых клеток в течение 15 минут после подготовки.
