JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Функциональный анализ из питания личинок округа в Дрозофилы

Full Text

10,550 Views

09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Схема питания в Дрозофилы личинок служит простой, но мощный модель, которая позволяет изменения в скорости подачи, коррелирует с изменениями в стоматогастральных нервной схемы. Эта схема состоит из нейронов центральной серотонинергической, которые посылают проекции к устью крючков, а также передней кишки.

Transcript

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать модельную систему дрозофилы для корреляции поведенческих выходов с изменениями в нейронной архитектуре. Это достигается путем создания популяционных клеток взрослых дрозофил для сбора личинок. Следующим этапом процедуры является оценка двигательных способностей личинок позднего второго и начала третьего возраста.

Третий шаг заключается в оценке пищевого поведения личинок путем наблюдения за выдвижением и втягиванием их ротовых крючков. Заключительным этапом является препарирование и подготовка проверенных образцов желудочков от личинок позднего третьего возраста с использованием иммуногистохимических методов. В конечном счете, результаты могут показать, как аберрации в нейронной архитектуре во время развития связаны с поведенческими изменениями благодаря комбинированному использованию поведенческих анализов и иммунофлуоресцентной микроскопии.

Применение этого метода простирается на лучшее понимание развития нейронной архитектуры, что позволяет лучше понять развитие неврологических заболеваний. Демонстрировать процедуру будет праг бот аспирант в своей лаборатории. Поддерживайте температуру в клетках популяции дрозофил при температуре 25 градусов Цельсия в течение 12-часового цикла светлой темноты.

До тех пор, пока контрольная и экспериментальная группы подвергаются воздействию одинаковых условий освещения, то этот метод может быть выполнен в стандартных лабораторных условиях. Используя сложившиеся популяции, собирайте личинок, позволяя самкам откладывать яйца на ночь на яблочном соке. Агаровые пластины поменяйте на тарелку утром и положите небольшую ложку дрожжей в центр собранной тарелки.

Дрожжи привлекут вылупившихся личинок, позволят яйцам развиваться в течение 24 часов при температуре 25 градусов Цельсия, а на следующий день соберут из пасты первых личинок возраста. С помощью металлического шпателя перенесите личинок на тарелку со свежим яблочным или виноградным соком. Дополнительная дрожжевая паста может быть добавлена для питания личинок до тех пор, пока не будут проведены анализы для сбора личинок второго и раннего третьего возраста, что позволит первому возрасту состариться в течение 40-48 часов.

В течение этого периода нормы кормления постоянны для сбора. Личинки позднего третьего возраста поднимают личинок в бутылки. Выращивание личинок позднего третьего возраста на соковых пластинах может быть вредным из-за накопления сельскохозяйственных культур в соматической желудочной системе.

Возраст личинок может быть подтвержден морфологией крюка рта, так как в этой структуре есть отчетливые изменения. С каждой личиночной плесенью соберите личинок конца второго и начала третьего возраста, аккуратно и тщательно промыв пластину с соком водой и вылив личинки в сетчатый фильтр, затем приступайте к поведенческому анализу. Поместите одну личинку позднего второго или начала третьего возраста на субстрат с 2%-ным акром в 100-миллиметровую чашку для культуры тканей и дайте личинкам акклиматизироваться в течение 30 секунд ровно на одну минуту.

Используя счетчик, подсчитывайте каждое движение сзади и вперед по субстрату, оценивайте каждое сокращение, которое происходит на трех четвертях тела животного. Когда личинки раскачиваются из стороны в сторону, но фактически не меняют положение, эти движения не засчитываются. Иногда полное переднее к заднему сокращению вызывает движение назад, похожее на передвижение вперед.

Также учитывается передвижение в обратном направлении. Замените пробирную пластину после того, как будет протестировано не более 10 животных. Сделайте не менее 20 записей в каждом экспериментальном условии.

Оцените каждую личинку, используемую в анализе опорно-двигательного аппарата, в анализе кормления с помощью тупого инокса. Номер пять, пинцет. Осторожно перенесите личинку с опорной сельскохозяйственной пластины в центр заполненной сельскохозяйственной пластиной, покрытой пятью миллилитрами однородного дрожжевого раствора.

В дрожжевом растворе личинки в основном остаются на месте, а кормление кормом напрямую коррелирует со скоростью сокращений ротового крючка, которые рассматриваются как расширение и втягивание прав глоточного крюка головного мозга Дайте личинкам акклиматизироваться в течение 30 секунд, а затем в течение одной минуты запишите количество сокращений ротового крючка с помощью счетчика. Начните с загрузки свежеприготовленного формальдегида класса 4% EM в PBS в стекло с тремя лунками. Затем перенесите блуждающую личинку третьего возраста в чашку для вскрытия с PBS.

Одним щипцом придерживайте задний конец, а другим придерживайте крючок для рта, удерживая задний конец неподвижным. Аккуратно потяните за крючки для рта, чтобы получить доступ к кишкам. Удалите все связанные с этим ткани, такие как слюнные железы, мозг, жировое тело и так далее.

Затем переложите каждую кишку в трехлуночную чашку, содержащую фиксацию формальдегида. Инкубируйте кишки при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи в непрозрачной коробке для культуры тканей. На следующий день перед удалением фиксирующего раствора удалите желудочную секу и зафиксируйте среднюю кишку рядом с проверенными желудочками, чтобы проекции можно было четко видеть без препятствий.

Теперь замените фиксатор одним XPBT и дайте тканям инкубироваться в течение 10 минут с легким покачиванием. Выполните эту промывку PBT шесть раз. Затем добавьте серотонин, который усилит передачу сигналов серотонина, не влияя на нейронную архитектуру.

Затем высиживайте кишки в течение часа при четырех градусах Цельсия без раскачивания. Через час тщательно промойте кишки с ПБТ шесть раз, как это было сделано, чтобы удалить первичное антитело. Затем инкубируйте кишки в течение ночи при четырех градусах Цельсия с первичными антителами против серотонина.

На следующий день повторите шесть промываний PPT, а затем инкубируйте вторичные антитела при четырех градусах Цельсия в течение 90 минут. Используйте один к 400 Alexa floor 5 68 goat anti-US, или один к 400 anti rabbit IgG. Удалите вторичное антитело с помощью режима промывки PBT, а затем инкубируйте кишки в четырех миллимолярах карбоната натрия с легким покачиванием в течение 10 минут.

Затем кишки могут быть помещены в 4%-ный N-галлат пропилгаллата с 20 миллимолярным карбонатом натрия в качестве буфера и просматриваться под флуоресценцией при 400-кратном увеличении для анализа. Избегайте съемки на заднем конце проверенных желудочков, потому что эти волокна плотно связаны. Больше задних волокон в средней кишке более разветвлены, потому что они фасцикулируют при попадании в ткани.

Нейритовые волокна могут быть количественно определены с помощью коммерческого программного обеспечения, такого как neuro lucita и neuro Explorer, путем ручного расчета или с помощью свободно доступного программного обеспечения. Простые нечеткие изображения неритовых индикаторов затруднят различение волокна и варикозного расширения вен и не должны использоваться, если архитектура волокна четко различима на фоне. И если по длине нерита удается выявить отдельные варикозные расширения, препарат подходит для анализа.

Кроме того, если отдельные варикозные расширения вен могут быть идентифицированы по остальной клетчатке, это еще один показатель качественного изображения для анализа. Аксональные волокна, выступающие из мозга, связываются в рецидивирующий нерв и не подходят для анализа до тех пор, пока они не достигнут доказанного желудочка, где они разделяются и иннервируются. Стеаматическая желудочная система Анализируйте все волокна, за исключением тех, которые находятся вне зоны фокуса.

В некоторых случаях волокна будут изгибаться между несколькими плоскостями фокуса, прослеживать отдельные проекции волокон от мозга к проверенным желудочкам и подсчитывать варикозные расширения вен и ветви, а затем вычислять частоту больших варикозных расширений вен на единицу длины. Изучение серотонинергической схемы питания эффективно для анализа влияния отдельных факторов на развитие нервной системы. Количественно оценивая скорость подачи, можно связать аксональную архитектуру контура подачи с его функциональным выходом.

Локомоторный анализ не показывает различий в локомоторных реакциях между контрольным и мутантным генотипами. Если мутации затрагивают только цепь питания, мутантное тело эллипсоида открывается. EBO 3 имеет структурный дефект в эллипсоидном теле центрального комплекса.

Родительский сорт дикого типа. CSWU показал, что ЭО 3 приводит к угнетению кормления при отсутствии влияния на передвижение. Дефекты развития у мутантов EO 3 повлияли на уратную архитектуру кишечника.

Эти личинки демонстрировали больше ветвлений, а также больше варикозных расширений, как маленьких, так и больших, по длине уратов. Обратите внимание на узлы ветвей в стрелках, варикозные расширения вен в наконечниках стрелок и большие варикозные расширения вен в звездочке. Эти изменения в нейронном ветвлении были количественно оценены для статистического анализа.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нельзя повредить личинки или рассеченные образцы тканей.

Explore More Videos

Неврология выпуск 81 нервные пути Дрозофилы Микроскопия нейровизуализации Поведение Поведение Механизмы Допамин Иммуногистохимия аксонов железистого серотонин варикоз животная модель