Исследование действия пробиотиков на пневмококковой колонизации Использование Экстракорпоральное Соблюдение Анализ

Общая цель этой процедуры заключается в изучении способности пробиотических клеток стрептококка levarius ингибировать адгезию пневмококка к эпителиальной клеточной линии. Это достигается путем предварительного получения монослоев эпителиальных клеток CCL 23. В 24-луночном планшете к монослою последовательно добавляются словар и пневмококки, и клетки инкубируются.

На заключительном этапе лунки промывают для удаления неприлипших бактерий. Эпителиальные клетки CCL 23 лизируют, и содержимое лунок собирают. В конечном счете, влияние слюникеза на приверженность к пневмококковой инфекции можно оценить путем количественной оценки количества клеточно-ассоциированных пневмококков.

Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области инфекционных заболеваний, например, могут ли пробиотики подавлять прилипание бактериальных патогенов, таких как пневмококк. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали изучать потенциальное использование лактобактерий гипноза, ГГ и других пробиотиков в дыхательных путях. Демонстрировать эту процедуру будут Джейн Мэннинг и Дзен до аспирантов из нашей лаборатории. За день до начала эксперимента расщепляют до культуры слияния CCL 23 эпителиальные клетки, а затем разводят их в предварительной теплой среде до концентрации 150 000 клеток на миллилитр в стерильной 50-миллилитровой пробирке.

Затем засемените по одному миллилитру клеток в лунку в обработанную 24-луночную тканевую культуральную тарелку и инкубируйте клетки в течение ночи. Затем с помощью петли объемом 10 микролитров введите от 10 до 12 хорошо отделенных колоний каждой бактериальной культуры в 10 миллилитров аликвоты бульона Тодда Хьюитта плюс 0,5% дрожжевого экстракта. Кратковременно сделайте вихрь и инкубируйте культуры в течение 14-16 часов в день эксперимента.

Ввергните каждую из бактериальных культур в течение трех-пяти секунд, затем добавьте 100 микролитров пневмококков и 100 микролитров слюны в помеченные предварительно теплые пробирки, содержащие 10 миллилитров бульона. Ввергните инокулированные пробирки в течение трех-пяти секунд и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы вырастить культуры до середины фазы бревна. После подтверждения не менее 80%-ной текучести клеточной культуры CCL 23 используйте трансферную пипетку для удаления среды из каждой лунки 24-луночного планшета, слегка наклонив планшет, чтобы не нарушить монослой клеток, затем дважды промойте лунки, добавив примерно 500 микролитров предварительно подогретого PBS и осторожно удалите жидкость с помощью трансферной пипетки.

Наклоняйте пластину во время стирки, чтобы сохранить монослой после второй стирки. Добавьте по 500 микролитров предварительно подогретых сред в каждую лунку и верните планшет в инкубатор на время подготовки бактериальных культур. Сначала измерьте оптическую плотность одного миллилитра культуры левариуса при концентрации абсорбента 600.

Затем перелейте пять миллилитров культуры Сала Левариуса в 10-миллилитровую пробирку и центрифугируйте в пробирке в течение четырех минут при 1,870 G при комнатной температуре. После выброса сната Ресуссури суспендировать гранулу в дозе от 200 до 1000 микролитров в дозе 85% натрия хлорида в зависимости от показаний наружного диаметра до конечной концентрации примерно 1,5 умножить на 10 до девятых колониеобразующих единиц на миллилитр. Добавление правильного количества бактерий является самой сложной частью эксперимента, поскольку фактическое количество добавленных бактерий не определяется до тех пор, пока на следующий день не будет проведен подсчет колоний.

Теперь перенесите ресуспендированную инокуляцию слюны в микропробирку с маркировкой high. Разбавьте высокую концентрацию в соотношении один к 10 и от одного до 100 в более чем пункте 85% хлорида натрия для получения средних и низких концентраций альвара для анализа вихревых трубок между разведениями для создания контрольных лунок гепарина. Удалите по 40 микролитров среды из каждой контрольной лунки и добавьте 50 микролитров гепарина до конечной концентрации 100 единиц на миллилитр на лунку.

Добавьте 10 микролитров точечного, 85% хлорида натрия только к CCL 23 клеткам, и CCL 23 клетки плюс пневмококки только полностью облегают все концентрации SIV областей. Затем добавьте по 10 микролитров неразбавленного одного к 10 и одного до 100 siv различных концентраций в соответствующие лунки, чтобы способствовать контакту бактерий с клеткой. Монослойную центрифугирование планшета в течение трех минут при давлении 114 G при комнатной температуре, а затем инкубирование планшета в течение часа, пока клетки инкубируются последовательно, разбавьте запас слюны в точке 85% хлорида натрия и используйте стерильный разбрасыватель для диспергирования 100 микролитров из 10 до минус пяти, 10 до минус шести и 10 до минус семи в двух экземплярах на агаровых планшетах с кровью лошади

Культивируйте пластины в перевернутом положении в течение ночи ближе к концу монослоя по мере инкубации салваров. Измерьте оптическую плотность культуры пневмококка, а затем опустите один миллилитр клеток. Резус суспендирует гранулу в дозе от 300 до 2000 микролитров 85% хлорида натрия в зависимости от показаний наружного диаметра до конечной концентрации примерно 150 миллионов колониеобразующих единиц на миллилитр.

Затем добавьте 10 микролитров неразбавленного пневмококка во все лунки, кроме отрицательных контрольных лунок, снова центрифугируйте 24-луночный планшет, а затем инкубируйте сокультуры в течение трех часов на этапе инкубации. Последовательно разбавляйте и тарелируйте пневмококковый подвой таким же образом, как и слюноотделение. После трех часов инкубации проверьте клетки под микроскопом на предмет цитопатического эффекта.

Теперь удалите среду из каждой лунки и аккуратно промойте сокультуры три раза одним XPBS, чтобы удалить неадгезивные бактерии, стараясь не потревожить монослои. Затем клетки облизывают 200 микролитрами 0,1%. Копайте в течение семи минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Далее добавьте в каждый по 800 микролитров бат.

Сделайте пипетку вверх и вниз несколько раз и соберите клеточные суспензии из каждой лунки в помеченные микроцентрифужные пробирки. Наконец, последовательно разводите адгезивные пневмококки, а затем подсчитывайте колонии на следующий день на соответствующих разбавляющих планшетах. Для количественного определения пневмококков и альваров в этой таблице приведены результаты репрезентативного эксперимента, в котором пневмококки были добавлены к клеткам CCL 23 через час после добавления словара.

Пневмококковая адгезия количественно оценивалась как по количеству жизнеспособных бактерий, так и по литу. Результаты A-Q-P-C-R были согласованы между двумя методами как по абсолютному числу бактерий, так и по проценту приверженности. Нормируется количество прилипших пневмококков в лунках, содержащих только пневмококки.

Гепарин используется в качестве контроля, так как известно, что он подавляет адгезию пневмококка. Таким образом, снижение приверженности примерно на 40% или более в образцах с пневмококками и гепарином по сравнению с только пневмококковым заболеванием свидетельствует об успешном анализе. Поскольку слюна ингибирует прилипание пневмококка дозозависимым образом, при этом высокая концентрация слюны примерно 10 слюных против одного пневмококка привела к самой низкой адгезии пневмококка.

Эти трансплантаты демонстрируют адгезию пневмококков к клеткам CCL 23 при добавлении саливариуса, за час до пневмококка одновременно или через час после пневмококков. Альвар более эффективен в ингибировании адгезии пневмококковой инфекции при добавлении до пневмококковой инфекции, поскольку как высокая, так и средняя дозы Альвара значительно снижают адгезию пневмококковой инфекции в анализе до выпуска. В то время как в Coit edition и post edition анализируются только высокие дозы Slovar, ингибирующие адгезию пневмококка.

Таким образом, после просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить анализ in vitro для измерения ингибирования прилипания пневмококка к пробиотическим клеткам стрептококка.