Ударно-волновой Применение к клеточных культур
8 апреля 2014 г.
Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Поэтому эксперименты в пробирке из растущего интереса. Поэтому мы разработали модель для в пробирке ударных волн исследований (IVSWT), что позволяет нам имитировать в условиях естественных условиях, благодаря чему исключаются отвлекающие физические эффекты.
Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы избежать отвлекающих физических эффектов во время ударно-волновой терапии in vitro для достижения воспроизводимых результатов. Это достигается путем первоначального полного заполнения флакона с культурой клеток питательной средой с последующим помещением флакона в подогреваемую водяную баню. На втором этапе при сопряжении аппликатора с водяной баней необходимо использовать достаточное количество ультразвукового геля.
Затем аппликатор горизонтально прижимают к мембране водяной бани. На заключительном этапе необходимо убедиться, что источник ударных волн находится на одной линии с центром флакона с клеточной культурой, чтобы клетки располагались в фокусе волны. В конечном итоге можно провести анализ клеток, например, с помощью ПЦР в реальном времени и цитокинового массива, чтобы выявить изменения в интересующих генах и цитокинах.
Идея данной модели возникла у нас после того, как мы заметили, что существующие методы прямого воздействия коротких волн на клеточные культуры не учитывают эффект отражения волн при переходе из культуральной среды в окружающий воздух. Процедуру продемонстрирует доктор Чанте, аспирант моей исследовательской группы. Для начала нагрейте 3,5 литров водопроводной воды до 37 °C.
Затем перелейте нагретую воду в водяную баню. Уровень воды должен быть на три сантиметра ниже верхнего края водяной бани и полностью покрывать мембрану. Далее подключите датчик температуры к источнику питания и поместите его в соответствующее отверстие на задней стенке водяной бани.
Затем, при перемешивании воды, подключите нагреватель к источнику питания и нагрейте воду до стабильной температуры 37 °C. В стерильных условиях высейте клетки в культуральные флаконы T 25.
Таким образом, после инкубации в течение ночи будет достигнута 90% конфлюэнтность. Затем установите колбы вертикально и заполните их культуральной средой до основания горлышка колбы, чтобы избежать контаминации. Не допускайте контакта среды с горлышком колбы или закрывающей крышкой.
Затем плотно закройте колбы пробками без фильтра, чтобы предотвратить загрязнение водой из водяной бани. После этого загерметизируйте пробки парафильмом. Когда колбы будут загерметизированы, закрепите их в штативе.
Затем поместите закрепленные флаконы в водяную баню и выровняйте их по центру флакона для культивирования клеток. Нанесите достаточное количество ультразвукового контактного геля на мембрану аппликатора ударно-волнового воздействия и на мембрану водяной бани. Затем присоедините аппликатор к мембране, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха между ними.
Затем приложите аппликатор для ударно-волновой терапии к центру мембраны и убедитесь, что он выровнен по горизонтали и вертикали относительно флакона с клеточной культурой, чтобы гарантировать воздействие на всю область роста клеток. После этого проведите предварительный эксперимент для определения оптимального расстояния между аппликатором и флаконом с культурой, а также для установления правильных параметров обработки. Убедитесь, что флакон с культурой и аппликатор зафиксированы в стабильном положении во время активации устройства для ударно-волновой терапии.
После определения оптимального расстояния проведите эксперимент в соответствии с заданными параметрами ударно-волнового воздействия. По завершении обработки извлеките флакон с клеточной культурой из водяной бани, просушите его бумажными полотенцами и продезинфицируйте внешнюю поверхность флакона. Затем перенесите среду из флакона в центрифужную пробирку.
Осадите клетки при стандартных параметрах центрифугирования. Ресуспендируйте клеточный осадок в двух миллилитрах среды для культивирования клеток, затем перенесите клеточную суспензию обратно в колбу, содержащую пять миллилитров среды для культивирования клеток, и выращивайте клетки до достижения необходимой конфлюэнтности для экспериментов по анализу клеток. Анализ методом ПЦР в реальном времени эндотелиальных клеток пупочной вены человека выявил повышение уровней мРНК tie2 после воздействия ударной волны.
Это свидетельствует о том, что ударно-волновая терапия усиливает пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез. Уровни цитокинов в пупочной вене и количество эндотелиальных клеток были определены с помощью цитокинового массива.
Также было обнаружено значительное повышение уровней двух воспалительных цитокинов IL six и IL eight, оба из которых участвуют в воспалительном процессе, сопровождающем ангиогенез после его развития. Эта методика открыла путь многочисленным исследователям в области фундаментальной науки об ударных волнах для изучения эффектов на одном типе клеток в экспериментах in vitro. Мы надеемся убедить еще больше исследователей использовать эту модель для получения воспроизводимых и сопоставимых результатов в науке об ударных волнах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена модель испытаний ударных волн in vitro (IVSWT), разработанная для воспроизведения условий in vivo при минимизации побочных физических эффектов. Методология направлена на повышение воспроизводимости результатов в экспериментах по терапии ударными волнами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Регенеративная медицина
Общая информация
- Ударные волны известны своими регенеративными эффектами.
- Для изучения этих эффектов все чаще используются эксперименты in vitro.
- Минимизация физических помех имеет решающее значение для получения точных результатов.
- Воспроизведение условий in vivo может повысить достоверность экспериментов.
Цель исследования
- Разработка надежной модели in vitro для испытаний ударной волной.
- Исключение физических помех во время проведения процедуры.
- Достижение воспроизводимых результатов при клеточном анализе.
Используемые методы
- Заполнение флакона для культивирования клеток питательной средой.
- Помещение флакона в водяную баню с подогревом.
- Использование ультразвукового геля для эффективного прилегания аппликатора.
- Совмещение источника ударной волны с центром флакона.
Основные результаты
- Клетки располагают в фокусе волны для обеспечения оптимального воздействия.
- Для анализа можно использовать ПЦР в реальном времени и цитокиновые массивы.
- Можно наблюдать изменения в интересующих генах и цитокинах.
Выводы
- Модель IVSWT эффективно имитирует условия in vivo.
- Минимизация отвлекающих факторов способствует получению более воспроизводимых результатов.
- Данный подход может углубить понимание воздействия ударных волн на клетки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данная модель восполняет критический пробел в исследованиях ударных волн, обеспечивая возможность воспроизводимых исследований in vitro, которые максимально точно имитируют условия in vivo. Благодаря устранению артефактов отражения волн с помощью системы с водяной связью, она позволяет надежно снизить риски при изучении механизмов действия терапии ударными волнами на ранних этапах разработки. Такой подход повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней для ангиогенных и воспалительных путей, имеющих значение для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и заживления ран.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет исследовать пути механотрансдукции, связывающие воздействие физических ударных волн с биологическими ответами в эндотелиальных клетках.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированную платформу для однообразного применения физических стимулов в различных экспериментах.
- Прогностическая ценность: позволяет проверить гипотезы о влиянии ударных волн на экспрессию генов и высвобождение цитокинов, имеющих значение для ангиогенеза и воспаления.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает получение количественных, воспроизводимых результатов с помощью ПЦР в реальном времени и цитокиновых панелей для оценки модуляции сигнальных путей.
- Практическая ценность: Создает масштабируемую и многократную систему воздействия ударными волнами с минимальной технической вариабельностью.
- Готовность анализа: Позволяет получать стандартизированные биологические ответы, что обеспечивает надежную оценку соединений или стимулов при последующем скрининге.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между результатами in vitro и их значимостью in vivo путем воспроизведения физиологических условий распространения волны.
- Снижение механистических рисков: проясняет зависимость «доза-эффект» между интенсивностью физического стимула и биологическим ответом эндотелиальных клеток человека.
- Доклиническое моделирование: позволяет проводить предварительную оценку проангиогенных и противовоспалительных сигналов, индуцированных ударными волнами, перед началом исследований на животных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в общий процесс ранних этапов поиска, обеспечивая валидацию мишени за счет понимания механизмов действия перед переходом к идентификации ведущих соединений и доклиническим испытаниям эффективности.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез о влиянии ударных волн на экспрессию генов и секреторные профили эндотелия.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные молекулярные показатели, необходимые для стандартизации анализа и сравнения результатов различных экспериментов.
- Аналитика: позволяет проводить статистический анализ повышающей регуляции генов (например, Tie2) и повышения уровня цитокинов (IL-6, IL-8) для определения значимых биологических ответов.
- Трансляционные исследования: сопоставляют наблюдения за механотрансдукцией in vitro с известными ангиогенными и воспалительными процессами in vivo.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет адаптируемую платформу, применимую к различным типам клеток помимо моделей эндотелия для более широкого изучения сигнальных путей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения уровня шума, вызванного физическими артефактами при доставке ударной волны.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию между лабораториями и экспериментами за счет контролируемого распространения волны.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), обеспечивая более четкие механистические связи между физическим стимулом и клеточным ответом.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет проводить приоритезацию подходов на основе ударных волн с учетом рисков за счет уточнения порогов биологического эффекта.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, владение техникой стерильности и навыки эксплуатации оборудования для ударно-волновой терапии.
- Необходим доступ к источнику ударных волн, термостатируемой водяной бане и ультразвуковому гелю для обеспечения акустического контакта.
- Требуется стандартизация расположения флаконов, нанесения геля и контроля условий окружающей среды для обеспечения стабильности фокусировки волны.
- При переносе данной модели на другие типы клеток или иные культуральные сосуды необходимо учитывать особенности адаптации метода.
- Метод ограничен необходимостью валидации биологических ответов на различных клеточных линиях для подтверждения универсальности полученных данных о механотрансдукции.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Preparation of Water Bath for In Vitro Shock Wave Trials
1:59
Cell and Culture Flask Preparation
2:53
Application of Shock Waves to the Water Bath
3:47
Cell Analysis Post-shock Wave Treatment
4:27
Results: Shock Wave Treatment of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
5:03
Conclusion
