Оценивая изменения в летучих общим наркозом чувствительность мышей после местного или системного фармакологического вмешательства
16 октября 2013 г.
Потеря рефлекса выпрямления долгое время служил в качестве стандартного поведенческого суррогата бессознательности, которая также называется гипноз, у лабораторных животных. Изменения в летучее анестезирующее чувствительности, вызванные фармакологических вмешательств могут быть обнаружены с тщательно контролируемой системы оценки высокой пропускной, которые могут быть адаптированы для доставки любого ингаляционного терапевтического.
Общей целью этой процедуры является оценка изменений чувствительности к анестетику после фармакологического вмешательства. Это достигается путем тщательной проверки камер выдержки, чтобы обеспечить равномерный расход газа и температуру. Второй шаг – приучение животных к камерам.
Далее проводится интересующее внимание фармакологическое вмешательство. Заключительным этапом является оценка изменений чувствительности к анестетику путем оценки пишущего рефлекса животного в ответ на воздействие анестетика. В конечном счете, рефлекторные анализы письма используются для выявления различий в чувствительности к анестетикам, вызванных фармакологическими вмешательствами длительного или короткого действия.
Хотя эта система может дать представление об изменениях чувствительности к анестетикам у мышей, она также может быть использована на различных видах для изучения эффектов любого ингаляционного терапевтического средства. Испытательный аппарат состоит из 24 прозрачных акриловых цилиндрических камер длиной 10 сантиметров и диаметром пять сантиметров. Этот размер подходит для типичной взрослой мыши весом 25 грамм.
Каждая камера имеет порт на каждом конце для входа и выхода газа. Выпускной конец герметизирован резиновыми прокладками, чтобы его можно было легко снять. Для введения животного установите каждую камеру на стойку, которая находится внутри водяной бани.
Установите стеллаж так, чтобы в воду была погружена только нижняя часть камер. Опора на заднем конце камеры обеспечивает устойчивость и удерживает камеры в горизонтальном положении, обеспечивая равномерный контакт каждой камеры с ванной. После подключения кислородного баллона к испарителю и расходомеру с полиэтиленовой трубкой разделите трубку на 25 резисторов малого диаметра равной длины.
Это гарантирует, что при подключении в каждую камеру подается одинаковый поток. Затем подсоедините вакуумные линии, выходящие из каждой камеры, на противоположном конце входного отверстия газа. Вакуумные линии объединяются в коллектор для подключения к собственной всасывающей линии.
Выдвижной клапан вдоль главной вакуумной линии обеспечивает атмосферное давление в каждой камере. Как только все будет соединено, наполните ванну достаточным количеством воды, чтобы полностью соприкасаться со дном каждой камеры. Включите насос для циркуляции воды и поддерживайте постоянную температуру 37 градусов по Цельсию.
Прежде чем приступить к испытаниям, камеры осматриваются на предмет утечек и надлежащего потока воздуха. Во-первых, установите уровень кислорода на уровне пяти литров в минуту. Погрузите каждую камеру в воду и ищите пузырьки или попадание воды, которые указывают на утечки.
Перед началом эксперимента замените все протекающие камеры. Для каждой камеры подключите расходомер со скоростью 500 миллилитров в минуту в линию перед камерой, чтобы убедиться, что потоки сбалансированы по каждой линии. Трубки любой камеры, не получающей ожидаемого потока, должны быть проверены на наличие препятствий.
Наконец, откалибруйте анализатор агентов так, чтобы он показал 0,0% изофтора при подаче 100% кислорода за неделю до привыкания. Транспондеры имплантируются для отслеживания температуры тела во время испытаний. После достижения должной глубины анестезии простерилизуйте область тыльной стороны шеи Бетадином.
Далее с помощью стерильной иглы введите температурные транспондеры подкожно между лопатками. Ежедневно контролируйте место инъекции на предмет инфицирования и миграции транспондера. За четыре дня до первой оценки всех подопытных животных приучают к камерам, чтобы уменьшить последствия стресса из-за новой среды.
Для этого поместите животное в каждую камеру со 100% потоком кислорода в течение двух часов. Повторяйте это воздействие ежедневно до тестирования. После четырех дней проживания испытательный день начинается с воздействия интересующего фармакологического вмешательства.
Это вмешательство может быть стереотаксической инъекцией в определенную область мозга, внутривенной инъекцией или внутрибрюшинной инъекцией при фармакологических вмешательствах. При большой продолжительности действия проводится ступенчатое определение чувствительности к анестетику. Начните тестирование, поместив каждого животное в отдельные камеры со 100% потоком кислорода, как только все животные будут на месте.
Установите концентрацию изоф фтора на 0,4% на 15 минут. В течение последних двух минут этого периода оценивайте письменный рефлекс каждого животного, осторожно перекатывая камеру, пока мышь не окажется у него на спине. Письменный рефлекс считается неповрежденным, если мышь способна вернуть все свои лапы к полу камеры.
В течение двух минут запишите состояние записывающего рефлекса для каждой мыши и просканируйте каждую мышь на наличие данных о температуре. Затем увеличьте концентрацию изофа фтора примерно на 0,05% в течение 15 минут и оцените письменный рефлекс, как было показано ранее. Продолжайте увеличивать концентрацию анестетика до тех пор, пока все животные не потеряют свой письменный рефлекс.
При необходимости выход анестетика может быть измерен путем повторения ступенчатой оценки рефлекса письма по мере титрования концентрации анестетика в сторону снижения. Чтобы закончить эксперимент, выключите изофтор и промойте всю систему 100% кислородом в течение 15 минут для вмешательств меньшей продолжительности. Проводится испытание времени до появления влаги.
После помещения каждого животного в отдельные камеры со 100% потоком кислорода установите концентрацию изофа фтора на 1,2%. После нескольких минут воздействия анестезии осторожно перекатывайте каждую камеру, пока каждая мышь не останется на спине. Подтвердив потерю пишущего рефлекса, поддерживайте концентрацию изоофа фтора на уровне 1,2% в течение от 30 минут до одного часа в зависимости от ожидаемой продолжительности действия острого вмешательства. После выключения изофтора подайте 100% кислорода и измерьте время, пока каждое животное не положит все четыре лапы на пол.
Письменный рефлекс считается неповрежденным, когда животное может поставить все четыре лапы на пол три раза подряд. Здесь письменный рефлекс был проверен через неделю после того, как мне ввели растительную кислоту в вентральное латеральное предоперационное ядро. Было предсказано, что поражение этой области мозга снижает чувствительность к анестезии.
Тем не менее, не было обнаружено существенных различий в ступенчатой чувствительности к анестезии ни для индукции, ни для экстренной анестезии. В этом примере тест времени до появления влаги был проведен сразу после двустороннего микровведения I растительной кислоты. При введении в VLPO наблюдалось заметно более продолжительное гипноз по сравнению с инъекциями, поскольку близлежащая медиальная перегородка и транспортное средство контролировали ситуацию.
После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как оценить чувствительность к анестетику с помощью ступенчатого индукционного теста или теста на время до появления анестетика, гарантируя, что каждое животное подвергается воздействию одинаковых газовых потоков и температур
.Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании оцениваются изменения чувствительности к анестетикам у лабораторных животных после фармакологического вмешательства. Методика основана на оценке рефлекса восстановления нормального положения тела как поведенческого индикатора потери сознания, что может быть адаптировано для различных ингаляционных терапевтических средств.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Фармакология
- Поведенческая оценка
Теоретическая часть
- Рефлекс восстановления нормального положения тела является стандартным показателем уровня сознания у животных.
- Чувствительность к летучим анестетикам может изменяться под воздействием фармакологических агентов.
- Система высокопроизводительной оценки позволяет проводить контролируемые исследования.
- Данный метод может быть применен для различных видов животных.
Цель исследования
- Оценить влияние фармакологического вмешательства на чувствительность к анестетикам.
- Использовать рефлекс восстановления нормального положения тела в качестве показателя потери сознания.
- Разработать систему, которую можно адаптировать для различных видов ингаляционной терапии.
Используемые методы
- Подготовка экспозиционных камер для обеспечения равномерного потока газа и температуры.
- Привыкание животных к камерам перед проведением испытаний.
- Фармакологические вмешательства, осуществляемые с помощью различных методов инъекций.
- Оценка рефлекса восстановления нормального положения тела в ответ на воздействие анестетика.
Основные результаты
- После вмешательства наблюдались изменения чувствительности к анестетикам.
- Для оценки состояния бессознательности эффективно использовался рефлекс восстановления нормального положения тела.
- Система продемонстрировала адаптивность к различным видам животных и терапевтическим средствам.
- Результаты указали на возможные различия в чувствительности в зависимости от типа вмешательства.
Выводы
- Данное исследование предлагает надежный метод оценки чувствительности к анестетикам.
- Фармакологические вмешательства могут значительно изменять эффекты анестезии.
- Этот подход может углубить понимание механизмов действия анестетиков у различных видов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Оценка чувствительности к летучим анестетикам в доклинических моделях позволяет снизить механистические риски при разработке соединений, воздействующих на ЦНС, путем количественного определения их влияния на гипнотические состояния. Эта высокопроизводительная система поддерживает валидацию мишеней и фенотипический скрининг на ранних стадиях поиска новых препаратов, обеспечивая воспроизводимые количественные показатели поведенческого отклика. Она помогает принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), связывая фармакологические вмешательства с функциональными изменениями анестезиологического ответа, что снижает биологические риски на поздних этапах разработки нейропсихиатрических лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения изменений потери рефлекса выпрямления как суррогатного показателя модуляции гипнотического состояния.
- Операционная ценность: Обеспечивает одновременную оценку чувствительности к анестетикам у 24 животных, что увеличивает пропускную способность фармакологического скрининга.
- Прогностическая ценность: Позволяет характеризовать зависимость «доза-эффект» путем определения EC50 и коэффициента Хилла, что дает данные для оценки взаимодействия с мишенью и определения активности препарата.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает стандартизированные, контролируемые условия окружающей среды (температуру, поток газа) для минимизации вариабельности в поведенческих тестах.
- Эксплуатационная ценность: способствует стандартизации и воспроизводимости анализов за счет использования откалиброванных анализаторов реагентов и равномерного воздействия в камере.
- Полезность платформы: возможность адаптации для ингаляционного введения других соединений, что позволяет повторно использовать систему в токсикологических и фармакодинамических исследованиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет измерять кинетику индукции и выхода из наркоза, что способствует согласованности трансляционных биомаркеров при изучении эффектов препаратов на ЦНС.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность тестирования времени выхода из наркоза после острых или хронических вмешательств, что позволяет установить фармакокинетическую и фармакодинамическую корреляцию.
- Снижение рисков: Позволяет выявить пролонгированный гипноз или резистентность, что дает возможность на ранних этапах доклинической оценки зафиксировать побочные эффекты на ЦНС.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы поисковой биологии, обеспечивая возможность гипотетической оценки чувствительности к анестетикам после фармакологического вмешательства, что позволяет связать модуляцию мишени с функциональным результатом.
- Открывающая биология: способствует снижению рисков при изучении механизмов путем количественной оценки того, как вмешательства изменяют нейронные цепи, участвующие в регуляции сознания.
- Скрининг: обеспечивает количественные бинарные показатели рефлексов (сохранен/утрачен) при определенных концентрациях анестетиков, что позволяет проводить сравнительную оценку соединений.
- Аналитика: позволяет рассчитать значения EC50, наклон кривой Хилла и данные о времени восстановления для статистического сравнения групп лечения.
- Трансляционные исследования: связывают острые фармакологические эффекты с изменениями продолжительности гипнотического состояния, что актуально для разработки адъювантов к анестетикам.
- Корпоративное повторное использование: систему камер можно перепрофилировать для исследований ингаляционной токсикологии или мониторинга показателей жизнедеятельности в режиме реального времени, что максимизирует полезность инфраструктуры.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней в ЦНС, связывая молекулярное вмешательство с поведенческим фенотипом состояния бессознательности.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет контроля условий окружающей среды (водяная баня 37°C, равномерный поток газа, проверка герметичности) и протоколов привыкания.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем выявления соединений, которые неожиданно продлевают или сокращают гипноз, что указывает на побочную активность в ЦНС.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений с учетом рисков на основе изменений чувствительности к анестетикам, что снижает процент потерь на более поздних доклинических этапах.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области поведенческой нейробиологии и методов введения фармакологических препаратов (например, стереотаксических, внутривенных, внутрибрюшинных инъекций).
- Для обеспечения целостности данных требуется использование калиброванных анализаторов состава среды, расходомеров и систем мониторинга температуры.
- Необходима стандартизированная привыкание (4 дня по 2 часа в день при подаче 100% oxygen) для минимизации вариабельности, вызванной стрессом.
- При адаптации системы для животных других видов, кроме мышей, необходимо учитывать видоспецифические размеры камер и свойства анестезирующих средств.
- Метод ограничен оценкой поведенческих конечных точек; он не позволяет напрямую измерять молекулярные или электрофизиологические корреляты действия анестетика.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Test Apparatus Set-up
2:55
System Checking and Calibration
3:50
Temperature Transponder Implantation
4:22
Animal Habituation
5:02
Step-wise Testing os Anesthetic Sensitivity
6:35
Time to Emergence Testing
7:37
Results: Effect of Ibotenic Acid on Anesthetic Sensitivity
8:26
Conclusion
