Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация
12 апреля 2014 г.
Покадровый микроскопия позволяет визуализировать процессы развития. Рост или дрейф образцов во время получения изображения снижает способность точно следовать и измерения движения клетки в процессе разработки. Мы описываем использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерной образца дрейфа во времени.
TimeLapse Microscopy позволяет визуализировать процессы проявки, роста или смещения образца, которые происходят по этому изображению. Сбор данных может привести к невозможности следить или отслеживать движения клеток, следуя протоколу. Мы используем программное обеспечение с открытым исходным кодом для обработки изображений для коррекции трехмерного дрейфа с течением времени.
Захват серии оптических сечений в разных фокальных плоскостях позволяет создать трехмерную модель образца. Это можно расширить до четырех измерений путем создания покадровой серии наборов 3D-данных. В долгосрочных экспериментах с замедленной съемкой обычно наблюдается движение образца.
Это может быть вызвано точностью скольжения в аппаратном столе управления и фокусными положениями, в то время как в других случаях дрифтер в результате движений, вызванных ростом образца или гибкостью в пределах монтажной среды, существуют методы компенсации для ограничения этих движений с помощью многих усовершенствований аппаратных систем фокусировки и повышенной жесткости монтажной среды. Тем не менее, эти подходы не могут быть применены во многих случаях из-за необходимости создания визуализации, необходимой для обеспечения подходящих условий для поддержания образцов и коррекции роста. Для дрейфа образцов мы разработали плагин для использования платформы обработки изображений с открытым исходным кодом Фиджи.
Наш плагин правильного 3D-дрейфа способен формировать регистрацию фазовой корреляции для коррекции движения, которое происходит как роль или дрейф образца в трехмерных покадровых экспериментах в многоканальных экспериментах. Правильный плагин 3D дрифта использует один канал для определения необходимой коррекции. Затем эта поправка применяется к любым дополнительным каналам, что приводит к регистрации набора данных The four D.
Бесплатный веб-пакет с открытым исходным кодом. Fiji — это дистрибутивная ветвь, программа Image J, которая содержит предустановленные плагины для выполнения многочисленных процессов с данными, собранными в ходе экспериментов по микроскопии. Fiji предоставляет более простую архитектуру плагинов и включает в себя установку по умолчанию.
Копия правильного плагина трех EG, который мы будем использовать для этого анализа после завершения установки Open Fiji. Фиджи поддерживает импорт широкого спектра проприетарных форматов изображений для микроскопии. Это может быть достигнуто с помощью перетаскивания или с помощью пользовательской среды открытой микроскопии.
Плагин импорта биоформатов. Если набор данных превышает размер памяти, установленной в системе, откройте файл образа в виде виртуального стека и опции управления памятью. Набор данных, который мы будем использовать в этом анализе, был получен в результате эксперимента с трехмерными временными рядами трансгенной рыбки данио-рерио GFP, в которой GFP экспрессируется в скелетных мышцах.
Чтобы визуализировать ядра, эта трансгенная линия была введена с ядром, локализующим M cherry для лучшего представления этих флюористых полов, мы можем изменить таблицы поиска для каждого из этих каналов с помощью инструмента цветового канала. В течение собранного временного ряда кажется, что образец рыбы на молнии дрейфует в поле зрения. Она исправила этот дрифт, открыв правильный плагин 3D дрифта в подменю регистрации плагинов, установленных на Фиджи.
Маркеры продавца, которые либо широко выражены в выборке, либо не участвуют в рыночных событиях во время получения изображения, являются лучшим источником для коррекции дрейфа. В данном примере ACTA флуоресценция GFP в первом канале. Если память в вашей системе ограничена, выберите опцию виртуального стека и разрешите запуск плагина Correct 3D drift
.Исправленный набор данных будет иметь больший размер холста по сравнению с исходным. Учет движения образца. Генерация максимального проекционного изображения оптических сечений позволяет сравнивать дрейф, который был удален из корректируемого образца, который должен быть сделан
.Проекция максимальной интенсивности удаляет размерность из набора данных, но является полезным подходом для быстрого изучения результатов коррекции дрейфа. Здесь мы видим максимальное количество проекционных изображений для каждой точки привязки в их скорректированных и нескорректированных наборах данных. Когда этот покадровый эксперимент проецируется в виде одного изображения, становится очевидной степень дрейфа, которая может произойти даже в коротком покадровом эксперименте.
Поправки, внесенные путем регистрации дрейфа одного канала образца, также применяются ко всем остальным каналам, содержащимся в этом стеке изображений. Процедура коррекции дрейфа при ограниченном объеме памяти в вашей системе немного изменена. Выберите опцию Используемый виртуальный стек как в меню покупки формата, импорта, так и во всплывающем меню соответствующего плагина 3D дрифта.
Когда вы выберете этот параметр, вам будет предложено выбрать местоположение, в которое плагин может экспортировать отдельные файлы изображений для каждого сегмента канала и временной точки вашего эксперимента с интервальной съемкой. Сгенерированный виртуальный стек содержит ту же коррекцию дрейфа, что и в нашем предыдущем примере. Если мы откроем выбранное место сохранения, мы увидим результирующие отдельные файлы последовательности изображений Сгенерированные.
Чтобы открыть эту коллекцию файлов, используйте инструмент импорта последовательности изображений. В полученном файле не будут разделяться каналы, оптические участки или временные точки. Чтобы визуализировать эти функции, преобразуйте стек в гиперстек с использованием данных из файла журнала, введите количество каналов, оптических срезов и точек привязки, собранных в файле, Мы снова можем изменить таблицы поиска, чтобы настроить цвет, отображаемый в нашем эксперименте с интервальной съемкой.
Данный протокол корректирует дрейф, возникающий между временными точками, который происходит в пределах захвата одной временной точки, не может быть исправлен этим протоколом. Рекомендуется, чтобы параметры, используемые для получения изображений, сокращали время, затрачиваемое на захват каждой временной точки. Возможность корректировки дрейфа в программном обеспечении для постобработки позволяет анализировать и измерять движения клеток, которые в противном случае были бы навыками дрейфа образца.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Таймлапс-микроскопия позволяет визуализировать процессы развития, однако дрейф образца во время получения изображений может препятствовать точному отслеживанию перемещений клеток. В данном исследовании описывается использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерного дрейфа образца с течением времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микроскопия
- Обработка изображений
- Развитие клеток
Теоретическая часть
- Тайм-лапс микроскопия имеет решающее значение для наблюдения за процессами развития.
- Движение образца может осложнить отслеживание перемещения клеток.
- Программное обеспечение с открытым исходным кодом может предложить решения для коррекции дрейфа.
- Захват оптических срезов позволяет создавать трехмерные модели.
Цель исследования
- Повышение точности отслеживания перемещения клеток при таймлапс-микроскопии.
- Демонстрация эффективности программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом.
- Облегчение процесса создания трехмерных моделей на основе данных таймлапс-съемки.
Используемые методы
- Тайм-лапс микроскопия для регистрации процессов развития.
- Программное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции дрейфа.
- Получение оптических срезов в различных фокальных плоскостях.
- Создание тайм-лапс серий трехмерных наборов данных.
Основные результаты
- Успешная коррекция трехмерного дрифта образца.
- Улучшенная возможность отслеживания перемещений клеток во времени.
- Создание точных трехмерных моделей на основе данных таймлапс-микроскопии.
- Демонстрация полезности программного обеспечения с открытым исходным кодом в микроскопии.
Выводы
- Программное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом эффективно для коррекции дрейфа.
- Метод таймлапс-микроскопии может быть усовершенствован для исследований развития.
- Точное отслеживание перемещений клеток имеет важное значение для понимания процессов развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Дрейф образца при 4D-конфокальной таймлапс-визуализации вносит систематическую погрешность, которая снижает точность отслеживания перемещения клеток в исследованиях по биологии развития. Коррекция этого дрейфа с использованием методов фазовой корреляции с открытым исходным кодом позволяет достоверно количественно оценить клеточную динамику, что способствует снижению рисков при механистическом подтверждении мишеней и в рабочих процессах фенотипического скрининга. Данный подход повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска за счет того, что наблюдаемые перемещения отражают истинное биологическое поведение, а не инструментальные артефакты.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, отделяя истинные перемещения клеток от артефактов дрифта образца.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет точной функциональной валидации мишеней в анализах с интервальной съемкой.
- Прогностическая ценность: оптимизирует отбор проектов в портфеле за счет повышения достоверности фенотипических показателей при имиджинге живых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга, обеспечивая пространственную точность в 4D-наборах данных.
- Практическая ценность: повышает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет таймлапс-визуализации с коррекцией дрифта.
- Масштабируемость: обеспечивает возможность повторного использования платформы в многоканальных экспериментах путем применения одноканальной регистрации ко всем каналам.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает целостность данных от этапа открытия до доклинической валидации за счет коррекции смещения образцов, которое могло бы исказить анализ биомаркеров.
- Механистическое снижение рисков: повышает прогностическую ценность за счет обеспечения точного отслеживания миграции, пролиферации или дифференцировки клеток в моделях, релевантных для данного заболевания.
- Принятие решений с учетом рисков: поддерживает критерии перехода на следующие этапы разработки, предоставляя наборы данных без дрейфа для количественной фенотипической оценки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от раннего этапа поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических работ — за счет обеспечения качества данных в анализах визуализации живых клеток, используемых для валидации мишеней и сигнальных путей.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет устранения мешающих эффектов дрифта в 4D-наборах данных конфокальной микроскопии.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и количественные результаты путем стабилизации пространственных координат во времени для надежной оценки соединений.
- Аналитика: позволяет создавать 4D-наборы данных с коррекцией дрифта, что обеспечивает точное сравнение позиций и перемещений клеток в различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет сохранения пространственной точности в моделях заболеваний, используемых для сопоставления биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: представляет плагин для коррекции 3D-дрифта как переиспользуемый инструмент для стандартизации таймлапс-микроскопии в различных проектах и группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности, вызванной инструментальным дрифтом.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов 4D-конфокальной визуализации.
- Стратегическая ценность: Обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях, связанных с ложными фенотипическими сигналами.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения о дальнейшем продвижении проектов с учетом рисков на основе фенотипических данных, скорректированных с учетом дрифта.
Особенности реализации
- Требуются навыки обработки микроскопических изображений и опыт работы с платформами Fiji/ImageJ.
- Необходимы достаточные вычислительные ресурсы или возможность использования виртуальных стеков для работы с большими 4D-наборами данных.
- Требуется стандартизация протоколов коррекции дрифта между командами для обеспечения согласованности результатов в многопользовательских средах.
- При применении к различным типам образцов, средам для монтажа или методам визуализации могут потребоваться соответствующие адаптации.
- Метод ограничен коррекцией дрифта между временными точками; он не позволяет устранить движение внутри кадра или деформацию образца во время захвата изображения.
