Образец коррекция дрейфа После 4D конфокальной Покадровый Визуализация
12 апреля 2014 г.
Покадровый микроскопия позволяет визуализировать процессы развития. Рост или дрейф образцов во время получения изображения снижает способность точно следовать и измерения движения клетки в процессе разработки. Мы описываем использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерной образца дрейфа во времени.
Микроскопия в режиме Time-lapse позволяет визуализировать процессы развития, роста или дрейфа образца, происходящие на изображении. В результате сбора данных может возникнуть невозможность отследить или проследить перемещение клеток; далее приводится соответствующий протокол. Мы используем программное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерного дрейфа во времени.
Получение серии оптических срезов на разных фокальных плоскостях позволяет создать трехмерную модель образца. Этот метод можно расширить до четырех измерений, создав серию 3D-наборов данных с интервальной съемкой (таймлапс). В ходе длительных экспериментов с интервальной съемкой часто наблюдается смещение образца.
Это может быть вызвано погрешностями позиционирования аппаратного обеспечения, управляющего столиком и фокусным расстоянием, в то время как в других случаях дрифт возникает в результате смещений, вызванных ростом образца или гибкостью фиксирующей среды. Существуют методы компенсации для ограничения этих смещений, включая многочисленные усовершенствования аппаратных систем фокусировки и повышение жесткости фиксирующей среды. Однако во многих случаях такие подходы неприменимы из-за требований к установке визуализации, необходимых для обеспечения подходящих условий поддержания и роста образцов. Для коррекции дрифта образца нами был разработан плагин для платформы обработки изображений с открытым исходным кодом Fiji.
Наш плагин Correct 3D Drift позволяет выполнять регистрацию методом фазовой корреляции для компенсации смещений, возникающих в результате вращения или дрейфа образца в трехмерных таймлапс-экспериментах с использованием нескольких каналов. Плагин Correct 3D Drift использует один канал для определения необходимой коррекции. Затем эта коррекция применяется к остальным каналам, что обеспечивает регистрацию всего набора данных 4D.
Бесплатный веб-пакет с открытым исходным кодом. Fiji представляет собой дистрибутив-форк программы Image J, который содержит предустановленные плагины для выполнения многочисленных процедур обработки данных, полученных в ходе экспериментов с использованием микроскопии. Fiji обладает более простой архитектурой плагинов, которые включены в установку по умолчанию.
Копия соответствующего плагина three EG, который мы будем использовать для данного анализа, будет доступна после завершения установки. Откройте Fiji. Fiji поддерживает импорт огромного количества проприетарных форматов микроскопических изображений. Это можно сделать с помощью перетаскивания или через интерфейс пользователя Open microscopy environment.
Плагин импорта Bio-formats. Если набор данных превышает объем оперативной памяти, установленной в вашей системе, откройте файл изображения как виртуальный стек (virtual stack) и воспользуйтесь опцией управления памятью (memory Management). Набор данных, который мы будем использовать в данном анализе, был получен в ходе трехмерного эксперименту с временными рядами на трансгенных zebrafish ACTA1-GFP, в которых GFP экспрессируется в скелетных мышцах.
Для визуализации ядер в данную трансгенную линию была введена нуклео-локализованная M cherry; чтобы лучше отобразить эти флуоресцентные сигналы, можно изменить таблицы поиска (lookup tables) для каждого из этих каналов с помощью инструмента цветовых каналов. В ходе записи временного ряда заметно, что образец zebrafish сместился в поле зрения. Чтобы исправить этот дрейф, откройте плагин 3D drift в подменю Registration установленных плагинов в Fiji.
Маркеры, которые либо широко экспрессируются в образце, либо не участвуют в событиях маркировки во время получения изображений, являются наилучшим источником для коррекции дрейфа. В данном примере это ACTA one, флуоресценция GFP в первом канале. Если объем памяти вашей системы ограничен, выберите опцию виртуального стека (virtual stack) и запустите плагин Correct 3D drift.
Исправленный набор данных будет иметь больший размер холста по сравнению с оригиналом, что обусловлено перемещением образца. Создание максимальных проекционных изображений оптических срезов позволяет провести сравнение дрейфа, который был устранен в исправленном образце.
Метод максимальной интенсивности проекции удаляет одно измерение из набора данных, однако он является полезным подходом для быстрой проверки результатов коррекции дрейфа. Здесь представлены изображения максимальной проекции для каждой опорной точки в их скорректированных и нескорректированных наборах данных. Когда этот эксперимент с таймлапсом проецируется в виде одного изображения, становится очевидным объем дрейфа, который может возникнуть даже при кратковременном таймлапс-эксперименте.
Корректировки, внесенные путем регистрации дрейфа одного канала вашего образца, применяются и ко всем остальным каналам, содержащимся в данном стеке изображений. Процедура коррекции дрейфа при ограниченном объеме памяти в вашей системе немного изменена. Выберите опцию «использовать виртуальный стек» (used virtual stack) как в меню «Формат» → «Импорт» (buy format, import menu), так и во всплывающем меню плагина «Коррекция 3D-дрейфа» (correct 3D drift).
При выборе этого варианта вам будет предложено указать папку, в которую плагин сможет экспортировать отдельные файлы изображений для каждого канала, среза и временной точки вашего таймлапс-эксперимента. Созданный виртуальный стек содержит ту же коррекцию дрейфа, что и в нашем предыдущем примере. Если открыть выбранное место сохранения, мы увидим созданные в результате отдельные файлы последовательности изображений.
Для открытия этого набора файлов используйте инструмент импорта последовательности изображений (image sequence import tool). Полученный файл не будет разделять каналы, оптические срезы или временные точки. Чтобы визуализировать эти параметры, преобразуйте стек в гиперстек (hyper stack), используя данные из лог-файла: введите количество каналов, оптических срезов и временных точек, собранных в ходе эксперимента. Затем можно снова изменить таблицы поиска (lookup tables), чтобы настроить отображение цветов нашего таймлапс-эксперимента.
Данный протокол позволяет корректировать дрейф, возникающий между временными точками; дрейф, который происходит во время захвата одной временной точки, данным протоколом скорректировать невозможно. Мы рекомендуем использовать такие параметры сбора изображений, которые сокращают время захвата каждой временной точки. Возможность коррекции дрейфа в программном обеспечении для постобработки позволяет анализировать и измерять перемещения клеток, которые в противном случае были бы скрыты из-за дрейфа образца.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Таймлапс-микроскопия позволяет визуализировать процессы развития, однако дрейф образца во время получения изображений может препятствовать точному отслеживанию перемещений клеток. В данном исследовании описывается использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерного дрейфа образца с течением времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микроскопия
- Обработка изображений
- Развитие клеток
Теоретическая часть
- Тайм-лапс микроскопия имеет решающее значение для наблюдения за процессами развития.
- Движение образца может осложнить отслеживание перемещения клеток.
- Программное обеспечение с открытым исходным кодом может предложить решения для коррекции дрейфа.
- Захват оптических срезов позволяет создавать трехмерные модели.
Цель исследования
- Повышение точности отслеживания перемещения клеток при таймлапс-микроскопии.
- Демонстрация эффективности программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом.
- Облегчение процесса создания трехмерных моделей на основе данных таймлапс-съемки.
Используемые методы
- Тайм-лапс микроскопия для регистрации процессов развития.
- Программное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции дрейфа.
- Получение оптических срезов в различных фокальных плоскостях.
- Создание тайм-лапс серий трехмерных наборов данных.
Основные результаты
- Успешная коррекция трехмерного дрифта образца.
- Улучшенная возможность отслеживания перемещений клеток во времени.
- Создание точных трехмерных моделей на основе данных таймлапс-микроскопии.
- Демонстрация полезности программного обеспечения с открытым исходным кодом в микроскопии.
Выводы
- Программное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом эффективно для коррекции дрейфа.
- Метод таймлапс-микроскопии может быть усовершенствован для исследований развития.
- Точное отслеживание перемещений клеток имеет важное значение для понимания процессов развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Дрейф образца при 4D-конфокальной таймлапс-визуализации вносит систематическую погрешность, которая снижает точность отслеживания перемещения клеток в исследованиях по биологии развития. Коррекция этого дрейфа с использованием методов фазовой корреляции с открытым исходным кодом позволяет достоверно количественно оценить клеточную динамику, что способствует снижению рисков при механистическом подтверждении мишеней и в рабочих процессах фенотипического скрининга. Данный подход повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска за счет того, что наблюдаемые перемещения отражают истинное биологическое поведение, а не инструментальные артефакты.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, отделяя истинные перемещения клеток от артефактов дрифта образца.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет точной функциональной валидации мишеней в анализах с интервальной съемкой.
- Прогностическая ценность: оптимизирует отбор проектов в портфеле за счет повышения достоверности фенотипических показателей при имиджинге живых клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: подготавливает валидированные биологические системы для последующего скрининга, обеспечивая пространственную точность в 4D-наборах данных.
- Практическая ценность: повышает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет таймлапс-визуализации с коррекцией дрифта.
- Масштабируемость: обеспечивает возможность повторного использования платформы в многоканальных экспериментах путем применения одноканальной регистрации ко всем каналам.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает целостность данных от этапа открытия до доклинической валидации за счет коррекции смещения образцов, которое могло бы исказить анализ биомаркеров.
- Механистическое снижение рисков: повышает прогностическую ценность за счет обеспечения точного отслеживания миграции, пролиферации или дифференцировки клеток в моделях, релевантных для данного заболевания.
- Принятие решений с учетом рисков: поддерживает критерии перехода на следующие этапы разработки, предоставляя наборы данных без дрейфа для количественной фенотипической оценки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от раннего этапа поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических работ — за счет обеспечения качества данных в анализах визуализации живых клеток, используемых для валидации мишеней и сигнальных путей.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет устранения мешающих эффектов дрифта в 4D-наборах данных конфокальной микроскопии.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и количественные результаты путем стабилизации пространственных координат во времени для надежной оценки соединений.
- Аналитика: позволяет создавать 4D-наборы данных с коррекцией дрифта, что обеспечивает точное сравнение позиций и перемещений клеток в различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет сохранения пространственной точности в моделях заболеваний, используемых для сопоставления биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: представляет плагин для коррекции 3D-дрифта как переиспользуемый инструмент для стандартизации таймлапс-микроскопии в различных проектах и группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность, валидация мишеней, снижение механистической неопределенности, вызванной инструментальным дрифтом.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов 4D-конфокальной визуализации.
- Стратегическая ценность: Обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях, связанных с ложными фенотипическими сигналами.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения о дальнейшем продвижении проектов с учетом рисков на основе фенотипических данных, скорректированных с учетом дрифта.
Особенности реализации
- Требуются навыки обработки микроскопических изображений и опыт работы с платформами Fiji/ImageJ.
- Необходимы достаточные вычислительные ресурсы или возможность использования виртуальных стеков для работы с большими 4D-наборами данных.
- Требуется стандартизация протоколов коррекции дрифта между командами для обеспечения согласованности результатов в многопользовательских средах.
- При применении к различным типам образцов, средам для монтажа или методам визуализации могут потребоваться соответствующие адаптации.
- Метод ограничен коррекцией дрифта между временными точками; он не позволяет устранить движение внутри кадра или деформацию образца во время захвата изображения.
