Автоматизированная Разделение С. Элеганс Переменно колонизирована бактериальным патогеном

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы оценить вклад колонизации и связанного с ней ущерба в инициацию врожденных иммунных реакций в морской элегантности. Это достигается путем воздействия на синхронизированную популяцию молодых взрослых особей Pseudomonas arosa, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок или GFP, который производит популяцию червей, по-разному колонизированных патогеном. После дифференциального промывки колонизированные популяции червей разделяются на чистые популяции, фокусируясь на двух крайностях полностью колонизированных и неколонизированных червей.

Затем из этих популяций извлекают РНК и оценивают экспрессию иммунных генов в сравнении с червями, выращенными на непатогенных кишечных палочках. Для изучения взаимосвязи между иммунным ответом и колонизацией были получены результаты, показывающие, что врожденный иммунный ответ морской элегантности на parosa может быть отделен от колонизации патогена. Основное преимущество этой методики по сравнению с другими подходами к изучению инициации иммунного ответа в условиях морской элегантности заключается в том, что она учитывает изменчивость инфекции в теплых популяциях, что позволяет нам разделить различные аспекты инфекционного процесса.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о морской элегантности, врожденном иммунитете, например, о том, что является основой для инициирования врожденных иммунных реакций, причем с высокой пропускной способностью. Каково влияние различных генетических или экологических манипуляций на способность сопротивляться колонизации патогенов? Для начала выращивайте червей на нескольких нематодах, питательных средах или пластинах NGM, засеянных бактериями кишечной палочки, пока многие черви не достигнут стадии тяжести

Затем обработайте могильных животных раствором для приготовления яиц для получения синхронизированной культуры. Следующая тарелка. Яйца на нескольких 60-миллиметровых пластинах NGM засеяны бактериями с плотностью примерно от 150 до 200 яиц на пластине.

Минимум от 15 до 20 пластин понадобится для получения нескольких тысяч червей. Для эксперимента по сортировке пользователи должны использовать пластины большего диаметра с большим количеством яиц на пластине, если требуется большее количество червей. Инкубируйте планшеты при температуре 20 градусов Цельсия в течение двух дней, пока черви не достигнут стадии L 4 или молодой взрослой особи.

На следующий день после подготовки яйцеклетки инокулируйте A GFP, экспрессирующий культуру POSA, PA 14 GFP, в два миллилитра антибиотика Kings B.Medium. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия с перемешиванием в течение ночи. На следующий день культуру PA 14 GFP помещают на столько медленно убивающих планшетов, сколько необходимо для анализа на каждой 150-миллиметровой чашке Петри.

Пипеткой наберите от 75 до 100 микролитров насыщенной культуры и равномерно распределите. С помощью стерильного разбрасывателя стекла инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-24 часов. Достаньте тарелки с PA 14 GFP из инкубатора и дайте им остыть до комнатной температуры.

Между тем, чтобы собрать червей, выращенных на пластинах NGM, добавьте небольшое количество буфера M nine, достаточное для покрытия пластины. Аккуратно перекрутите пластину и перелейте жидкость в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Дайте червям осесть на дно и удалите лишнюю жидкость, прежде чем переносить червей на пластины PA 14 GFP В минимальном объеме жидкости, при использовании 150-миллиметровых пластин, на одной пластине можно разместить несколько сотен червей.

Инкубируйте планшеты при температуре 25 градусов Цельсия в течение 18-21 часа для молодых взрослых червей, подвергшихся воздействию parosa. Это временное окно, отображающее оптимальное распределение колонизированных и неколонизированных животных перед выполнением сортировки образцов, чтобы убедиться, что машина работает правильно. Основные шаги изложены здесь, а подробную информацию можно получить в Интернете.

Установите давление клапана оболочки примерно на пять фунтов на квадратный дюйм, чтобы убедиться в правильности расхода жидкости оболочки. Поместите коническую трубку объемом 15 миллилитров под диспенсер. Откройте клапан оболочки и закройте клапан сортировщика.

Удерживайте тюбик под дозатором в течение 60 секунд. Объем в тюбике должен составлять от девяти до 10 миллилитров. Если она находится за пределами этого диапазона.

Отрегулируйте давление клапана оболочки соответствующим образом, чтобы обеспечить точную сортировку. Проверьте норму сортировки, сначала закрыв клапан оболочки. Затем добавьте в резервуар около 25 миллилитров раствора контрольных частиц.

Включите клапан оболочки и клапан образца в компьютерной программе. Перейдите в режим управления частицами и нажмите кнопку «Получить». Убедитесь, что скорость потока частиц составляет примерно пять-восемь частиц в секунду, а время полета приблизительно равно ширине частицы размером 40 микрометров.

Это гарантирует, что за один раз пройдет только один объект размером 40 микрон. Если значения выходят за пределы этого диапазона, настройте параметры соответствующим образом. С помощью М девяти буфера промыть червей в конические трубки объемом 15 миллилитров, позволить взрослым червям самотеком опуститься на дно трубки и удалить надосадочную жидкость.

Заполните пробирку свежим буфером М девять. Повторите этот процесс три-четыре раза. При этом удаляется большая часть личинок, а также избыток бактерий и требуется около 10 минут.

Добавьте червей в резервуар для сортировки червей, содержащий аккуратно перемешивающий небольшой брусок для перемешивания. Отрегулируйте усиление начального сигнала, установив зеленый фотоумножитель на 600, а красный и желтый фотоумножитель на 200. Начните сбор данных, чтобы настроить параметры.

Стремитесь к частоте сортировки от 25 до 30 событий или червей в секунду. Если норма численности слишком высока, разведите червей в водоеме с помощью М девяти. Буферизуйте соответственно.

Если норма слишком низкая, добавьте больше червей в небольшом объеме М девять. Если эксперимент требует очень строгого разделения колонизированных и неколонизированных червей, установите проверку совпадения на чистую. Это гарантирует, что если два объекта окажутся слишком близко друг к другу или в одном падении, машина отбракует падение.

Вместо того чтобы собирать его для сортировки интересующей популяции, нарисуйте вентили вокруг оси, указывающие размер и интенсивность флуоресценции. Значения для флуоресцентного стробирования должны быть определены опытным путем. Затем поместите многолуночную тарелку или чашку Петри под диспенсер для сбора червей.

Затем откройте клапан сортировки, чтобы начать сортировку червей. Соберите небольшую популяцию животных, чтобы проверить под микроскопом, что отсортированная популяция является популяцией, представляющей интерес. Если нет, отрегулируйте параметры стробирования соответствующим образом и продолжите сбор образцов.

Когда возраст соответствовал генетически идентичной морской элегантности, которая подвергалась воздействию GFP, экспрессирующей posa, что привело к широкому распределению уровней колонизации, эффективное разделение неколонизированных червей от колонизированных было достигнуто с помощью сортировщика червей. В отличие от неколонизированных червей, колонизированные черви демонстрируют явные признаки, такие как вялость и снижение дефекации. Последнее может быть причиной того, что черви, колонизированные P. arosa, испытывают трудности с устранением инфекции.

Четыре гена были индуцированы аналогично воздействию P. arosa, независимо от статуса колонизации червей, и количественный R-T-P-C-R использовался для измерения экспрессии генов. Известно, что эти четыре гена являются частью иммунного ответа CL-egan. Lys 2 кодирует лизоцим, два нехарактерных гена реагируют специфически на инфекцию, один из которых также способствует устойчивости к инфекциям, а PGP 5 реагирует на инфекцию, а также на стресс тяжелых металлов.

Полученные результаты подтверждают ранее опубликованные результаты, указывающие на то, что колонизация и связанные с ней повреждения не требуются для иммунного ответа. Вместо этого мы указываем на молекулярные паттерны, связанные с патогенами, в качестве сигнальных данных, показывающих, что PGP 5 индуцируется у неколонизированных животных, которые не должны испытывать ее. Обширные повреждения свидетельствуют о наложении регуляторных программ, контролирующих иммунные реакции и общие реакции на стресс в морской элегантности.

Этот метод может дать новое представление об инициировании иммунных реакций в море, но он также может быть применен к другим вопросам, таким как влияние условий окружающей среды или генетических манипуляций на колонизацию или конкуренцию между различными патогенами, помимо инфекционных процессов. Этот метод также может быть применен для отслеживания других взаимодействий червей с окружающей средой, таких как проглатывание или секвестрация метаболитов или химических веществ. Следуя этой процедуре, отсортированные популяции, представляющие интерес, могут быть использованы для различных целей, выходящих за рамки экспрессии генов.

К ним относятся сбор живых животных для последующих тестов на заражение или выживание или поведенческих экспериментов. Этот метод является полезным средством для изучения влияния воздействия патогенов и колонизации на врожденный иммунитет и морскую элегантность.