Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Общая цель данной процедуры заключается в идентификации посттрансляционных модификаций белков, входящих в состав растительных белковых комплексов, которые сначала транзиентно или стабильно экспрессируются в растениях с помощью меток целевого белка. Затем из тканей растения экстрагируют общую фракцию белков и проводят иммунопреципитацию целевого белка. Далее иммунопреципитированные белки разделяют на акриламидном геле, после чего из соответствующей полосы геля экстрагируют и подвергают дигестии интересующие белки.

Теперь отправьте образцы белков на масс-спектрометрию. В конечном итоге результаты масс-спектрометрии позволяют обнаружить динамические изменения посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование. В отличие от альтернативных методов, таких как инкубация киназы с субстратом in vitro, данный метод обеспечивает экспрессию белков в растении.

Таким образом, вам не нужно заранее знать, какая киназа отвечает за фосфорилирование. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии растений, например, о том, как передаются сигналы в ответ на стресс, изменения окружающей среды или распознавание патогенов. Помимо идентификации сайтов фосфорилирования активированных комплексов белков устойчивости, данный метод может быть широко применен к любой посттрансляционной модификации любого растительного белкового комплекса.

Как правило, специалисты, которые впервые используют данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как они не привыкли работать с большими объемами экстракта и выполнять большее количество этапов протокола за один день. Для транзиентной экспрессии доведите штаммы agrobacterium tohin до стационарной фазы роста. Соберте агробактерии путем центрифугирования при 3000 Gs в течение пяти минут.

Ресуспендируйте осадки в буфере для инфильтрации. Затем проведите инфильтрацию четырехнедельных растений NCOA hamana агробактериями вручную с помощью одномиллилитрового шприца без иглы или методом вакуумной инфильтрации с использованием 0,02% сурфактанта; анализ проводится через два-пять дней после инфильтрации.

Соберите инфильтрированные листья, заморозьте их в жидком азоте и храните при температуре -80 °C. Затем разотрите 20 г растительной ткани в жидком азоте с помощью ступки и пестика, добавив к 20 г ткани 80 мл холодного буфера C. Тщательно перемешайте и разморозьте на льду.

Теперь гомогенизируйте пробу тремя импульсами по 10 секунд каждый на максимальной скорости. Отфильтруйте гомогенат и центрифугируйте при 30,000 Gs в течение 30 минут при температуре четырех градусов Цельсия. Тем временем к 100 µL подходящей аффинной матрицы добавьте 500 µL холодного блокирующего буфера D на пять минут при четырех градусах Цельсия и промойте трижды 1 mL холодного буфера D. Затем удалите супернатант экстракта листьев и пропустите его через шприцевой фильтр 0,45 мкм.

Профильтруйте в новую пробирку на льду. Разделите неочищенный экстракт на аликвоты. Для иммуноблоттинга.

Добавьте пять мкл буфера для загрузки электрофореза в SDS-PAGE, перемешайте на вортексе и прокипятите образцы для денатурации. В каждую пробирку добавьте 50 µL аффинной матрицы, суспендированной в буфере D. Инкубируйте при медленном перемешивании в течение двух часов при температуре 4 °C, затем центрифугируйте для осаждения аффинной матрицы.

Затем возьмите аликвоту несвязанного экстракта для иммуноблоттинга. Остальную часть удалите, оставив на дне пробирки примерно 500 µL. Ресуспендируйте полученную суспензию с помощью наконечника с широким отверстием.

Объедините смешанный суспензионный раствор из обеих пробирок в одну пробирку объемом 1,5 миллилитра. Трижды центрифугируйте в течение пяти секунд на настольной центрифуге для осаждения аффинной матрицы и удалите супернатант после трех-пяти промывок одним миллилитром холодного буфера D. Удалите излишки буфера D с помощью иглы шприца и проведите элюцию 200 микролитрами соответствующего элюирующего буфера при постоянном перемешивании. Объедините три элюата в одну пробирку.

Затем сконцентрируйте белки, используя 30 µL адсорбционной смолы с перемешиванием на вортексе. Выдержите смесь в течение пяти минут для осаждения смолы, после чего удалите супернатант. Добавьте 50 µL 1X буфера для нанесения на SDS-PAGE к осажденной аффинной матрице или адсорбционной смоле и прокипятите в течение 10 минут при температуре от 80 до 100 °C в термоблоке центрифуги.

Прокипятите аффинную матрицу с смолой в течение двух минут при 10 000. Отберите аликвоту супернатанта объемом 5 µL для иммуноблоттинга и нанесите ее вместе с другими фракциями на SDS-ПАГ гель длиной 10 см для разделения и идентификации фосфорилированных белков методом масс-спектрометрии.

Нанесите оставшиеся 45 µL на гель для SDS-PAGE. Окрасьте гель для SDS-PAGE коллоидным кумасси бриллиантовым синим. Затем обесцветьте гель путем тщательного промывания водой, желательно в течение ночи.

Теперь с помощью чистого скальпеля вырежьте интересующую полосу из геля, нарежьте срез геля кубиками размером от двух до четырех миллиметров и перенесите образец в пробирку. Промывайте кусочки геля 50% ацетонитрилом и 50 мМ бикарбонатом аммония до полного обесцвечивания. Затем удалите раствор с помощью пипетки.

Следите за тем, чтобы не removing фрагменты геля. Дегидратируйте образец 100% ацетонитрилом в течение пяти минут, затем удалите свободную жидкость. Далее, для восстановления дисульфидных связей белков, добавьте 10 мM DTT и инкубируйте от 30 до 45 минут при 56 °C с встряхиванием; после этого удалите свободную жидкость для проведения алкилирования остатков цистеина.

Добавьте 55 millimolar хлорацетамида на 20–30 минут при комнатной температуре в темноте. Удалите свободную жидкость, затем дважды промойте фрагменты геля 50% ацетонитрилом в течение 10 минут. Удалите свободную жидкость.

Теперь дегидратируйте фрагменты геля 100% ацетонитрилом в течение пяти минут и удалите свободную жидкость для проведения Triptych Digest. Добавьте 40 мкл рабочего раствора трипсина и дайте фрагментам геля регидратироваться в течение 10 минут в объеме буфера для переваривания, достаточном для полного покрытия фрагментов. Инкубируйте при 37 °C в течение ночи; затем остановите переваривание и экстрагируйте пептиды из фрагментов геля с помощью 5% муравьиной кислоты, подвергнув их ультразвуковой обработке в течение 5–10 минут.

Затем перенесите супернатант в новую пробирку, высушите пептиды методом лиофилизации или с помощью вакуум-концентратора и храните образцы при температуре -20 °C. В данном эксперименте purified P-R-F-P-T-O киназный комплекс из nacoa hamana. Трансгенный NACOA hamana, экспрессирующий 35 SPTO, был подвергнут транзиентной трансформации 35 SPRF flag, после чего комплекс был иммунопреципитирован с использованием Anti-Flag M two aros. Иммуноблоттинг демонстрирует эффективную иммунопреципитацию целевого белка PRF, при этом как PTO, так и взаимодействующий эффекторный белок ко-очищались вместе с PRF, что подтверждается детекцией антителами и масс-спектрометрическим анализом.

В данном случае стратегия заключалась в воздействии на белок PTO с помощью Anti-Flag. Стратегия была изменена с целью идентификации сайтов фосфорилирования PTO.

Общее количество белка PTO, включающее как комплекс PRF, так и свободную форму, было иммунопреципитировано с помощью антител Anti-Flag M2 и подвергнуто фракционированию методом SDS-PAGE, внутригелевому трипсиновому перевариванию и масс-спектрометрическому анализу, что позволило выявить пептиды PTO, охватывающие приблизительно 80% его последовательности. Примечательно, что был определен ряд сайтов единичного фосфорилирования для пептидов PTO. Следует отметить, что сайты двойного фосфорилирования были обнаружены только в присутствии одного из эффекторных белков.

Важно получить достаточное количество растительного белка, чтобы идентифицировать компоненты белкового комплекса, а также обнаружить посттрансляционные модификации интересующего белка. Помните, что картирование таких модификаций, как фосфорилирование, требует значительного количества белка для масс-спектрометрии, поэтому после выполнения данной процедуры на геле должна быть видна хотя бы слабая полоса. Другие методы, такие как идентификация компонентов комплекса, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, как активация иммунного комплекса приводит к функциональному иммунитету.

Не забывайте, что работа с органическими буферами, бактериями и лезвиями BBL может быть крайне опасной, поэтому соблюдайте меры предосторожности, такие как использование перчаток и лабораторных халатов.