Дизайн и анализ поведения предпочтения температуры и его циркадный ритм в Drosophila

Общая цель этой процедуры заключается в определении температурных предпочтений дрозофилы. Это достигается путем предварительной подготовки мух и аппарата, который собирается вокруг алюминиевой основы с регулируемой температурой. После того, как температура в аппарате установлена, когорта мух загружается внутрь, и через полчаса их температурные предпочтения оцениваются.

В конечном счете, анализ может быть использован в самых разных экспериментальных условиях. Например, циркадные ритмы температурного предпочтения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области целевых ритмов.

Поскольку эти целевые ритмы температурных предпочтений контролируются иными механизмами, чем активность локомотива, такой анализ поведения приведет к идентификации новых молекулярных и клеточных механизмов, которые ранее не были идентифицированы с помощью подходов к активности локомотивов. Этот метод также может помочь ответить на ключевые вопросы в области сенсорной нейробиологии, такие как температура и болевые ощущения. Поскольку этот температурный поведенческий анализ очень надежен, он позволит нам составить карту нейронной цепи от определения температуры до обработки, что позволит нам лучше понять сенсорную интеграцию.

Выращивайте мух во увлажненных инкубаторах с 1212 светлым темным циклом. Этот протокол требует, чтобы два таких инкубатора были настроены на противоположные графики. В обычное рабочее время в ночном инкубаторе должно быть темно.

При доступе к инкубатору в ночное время используйте красный свет для освещения инкубатора. Соберите когорты из 20-30 только что вылупившихся мух любого пола и в любом соотношении, подержите их в инкубаторе в течение двух-трех дней, прежде чем запускать их в анализ. Для каждого тестируемого состояния требуется не менее пяти когорт.

Чтобы построить камеру для тестирования температурных предпочтений, крышка из плексигласа должна быть спроектирована так, чтобы она подходила к алюминиевой пластине под пластиной. Разместите четыре приспособления Пельтье. Каждое из устройств пельтье должно быть подключено к терморегуляторам, которые могут генерировать холодную или горячую температуру, чтобы предотвратить перегрев пельтеров.

Компьютерная система охлаждения подключена к водяным трубкам, вентиляторам воздушного охлаждения и источникам питания для контроля температуры на алюминиевой пластине. Датчики температуры встраиваются в край алюминиевой пластины и подключаются к регуляторам температуры. Установите холодную и горячую стороны тарелки на 12 и 36 градусов Цельсия соответственно в крышке.

Прикрепите шесть датчиков температуры в различных положениях в пределах одной из дорожек. Поместите аппарат в помещение с контролируемой окружающей средой при температуре 25 градусов Цельсия и относительной влажности от 65 до 75%. Обязательно следите за этими условиями.

В комнате должен быть контроль освещенности и хорошая циркуляция воздуха, чтобы предотвратить дестабилизацию температуры циркулирующим воздухом. Градиентный экран испытательной зоны занавеской для душа. На устройстве должен использоваться равномерный свет, потому что яркость может влиять на температурные предпочтения.

Включите аппарат минимум на 30 минут. Для того, чтобы установить стабильный температурный градиент на поверхности пластины. Покройте крышку поведенческого аппарата водоотталкивающим средством, чтобы предотвратить забирание мух на стены или потолок крышки.

Сотрите излишки водоотталкивающего средства и оставьте крышку на 25-30 минут, при необходимости двойную клейкую ленту можно использовать через полчаса. Сотрите конденсат с алюминиевой пластины. Затем поместите крышку из плексигласа на алюминиевую пластину и закрепите шестью C-образными зажимами.

Очень важно, чтобы крышка была герметичной. Хорошо следите за температурой воздуха между плитой и крышкой. Следите за тем, чтобы щупы не касались ни алюминиевой пластины, ни крышки из оргстекла.

Дайте крышке отстояться на тарелке не менее 15 минут. В конечном итоге градиент температуры воздуха между алюминиевой пластиной и крышкой будет колебаться от 18 до 32 градусов по Цельсию В случае дневного поведенческого эксперимента достаньте флаконы с мухами из дневного инкубатора и протестируйте поведенческий анализ на свету непосредственно перед ночным поведенческим экспериментом. Достаньте флаконы с мухами из ночного инкубатора.

Заверните их в фольгу и поместите в коробку в темной комнате под красной лампой. При проведении экспериментов в темное время суток свет в комнате должен оставаться выключенным до тех пор, пока не будут завершены поведенческие эксперименты. Тем не менее, красные лампы можно использовать для освещения с помощью аспирации.

Груз от 20 до 25 летит в пространство между алюминиевой пластиной. Затем закройте отверстия покровными листами, чтобы предотвратить побег мух. Дайте мухам двигаться в течение 30 минут.

Когда эксперимент будет завершен, сделайте не менее двух фотографий для экспериментов со светом. Для экспериментов с темнотой необходимо использовать вспышку. Проверьте температуру аппарата.

Обратите внимание на температуру в помещении, а также влажность, чтобы удалить от мух подключенную трубку углекислого газа возле отверстия в верхней части аппарата для обезболивания мух, выбросьте мух. Они не должны подвергаться повторному тестированию. Затем сотрите с пластины конденсат или влагу.

Установите на место крышку на пластине и затяните зажимами при подготовке Для следующего эксперимента рассчитайте градиент температуры следующим образом. Во-первых, определите, где расположены датчики температуры, с помощью линейки на основе расположения датчиков и их зарегистрированной температуры. Нарисуйте прямые линии, представляющие каждый градус температуры в соответствующем положении на фотографии конечного положения мухи.

Затем подсчитайте количество мух между каждым интервалом в один градус Цельсия. Исключите попадание мух на стены или на потолок укрытия. Рассчитайте процент мух в каждом температурном диапазоне каждой дорожки, а затем среднюю предпочтительную температуру для каждого условия.

Соберите данные по крайней мере из пяти испытаний. Затем используйте средние значения каждой попытки для определения средней предпочтительной температуры с ошибками. Нормальные мухи, поднятые при температуре 25 градусов по Цельсию, предпочитают более низкую температуру утром, чем вечером.

В дневное время было зафиксировано увеличение температурного предпочтения на 1-1,5 градуса и на 1,5-2 градуса по Цельсию. Снижение наблюдалось при переходе от дня к ночи. Этот анализ также может быть использован для тестирования мутантных мух.

Например, было обнаружено, что температурное предпочтение мух, несущих дефектную мутацию, в трипе с одним ионным каналом выше, чем у контрольной группы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ температурных предпочтений. Этот метод позволяет исследовать молекулярные механизмы и нейронные цепи, а также то, как мозг интегрирует различные сигналы окружающей среды и биологические часы.