Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Общая цель данной процедуры — измерение цитотоксической активности антигенспецифических CD8 T-клеток с помощью клеточного анализа методом проточной цитометрии. Сначала эффекторные CD8 T-клетки экспансируют в течение шести дней в присутствии интересующего пептида; на втором этапе целевые CD4 T-клетки подвергают пульсации этим же пептидом, после чего их смешивают с непульсированными CD4 T-клетками. Затем эффекторные CD8 T-клетки и целевые CD4 T-клетки совместно культивируют в течение шести часов при различных соотношениях эффекторных клеток к целевым.

На заключительном этапе методом проточной цитометрии количественно определяют гибель нагруженных пептидом таргетных Т-клеток CD4 и количество эффекторных Т-клеток CD8. В конечном итоге можно рассчитать собственную киллинг-способность антигенспецифических Т-клеток CD8, выраженную в литических единицах. Основным преимуществом данного метода по сравнению с такими анализами, как тест на высвобождение хромофора, является то, что в данной технике используются аутологичные первичные таргетные клетки вместо иммортализованных клеточных линий и реальные таргетные клетки.

Кроме того, количество эффекторных клеток можно количественно определить на уровне отдельных клеток. Сейчас лаборант моей лаборатории продемонстрирует процедуру выделения CD8-положительных эффекторных клеток. Начните с размораживания аутологичных криоконсервированных PBMC в водяной бане при 37 °C, а затем промойте клетки в объеме до 50 mL полной среды.

После подсчета разведите PBMC до концентрации 5 миллионов клеток на миллилитр в полной среде, затем добавьте в культуру IL-2 и интересующий пептид. Далее перенесите по 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета. После трех дней культивирования замените половину супернатанта свежей полной средой. Через шесть дней культивирования с помощью многоканального дозатора перенесите клетки в стерильный резервуар, после чего проведите подсчет и промывку клеток.

Ресуспендируйте осадок в сепарационном буфере до концентрации 50 миллионов клеток на миллилитр и инкубируйте PBMC в пробирке с круглым дном объемом 14 миллилитров с коктейлем для обогащения человеческими T-клетками CD8+ в концентрации 50 мкл на миллилитр клеток при комнатной температуре. Через 10 минут инкубируйте клетки с магнитными частицами, конъюгированными с анти-CD8 IgG, в концентрации 150 мкл на миллилитр еще в течение пяти минут, затем доведите объем клеточной суспензии до семи миллилитров, добавив сепарационный буфер. Поместите пробирку в сепарационный магнит. Через пять минут, не вынимая пробирку из магнита, перелейте клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем окрасьте небольшую аликвоту клеток антителами к CD3 и CD8 в PBS с добавлением 2% FBS в течение 30 минут при температуре 4 °C.

Подтвердите с помощью проточной цитометрии, что чистота клеток составляет 95% CD8-положительных или выше. Добавьте по 225 µL полной среды в пять пробирок с завинчивающимися крышками, затем проведите серийное разведение клеток от 1:2 до 1:32. Для выделения целевых CD4-положительных клеток начните с размораживания аутологичных криоконсервированных PBMC в водяной бане при 37 °C.

Перенесите размороженные клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды. Проведите обогащение T-клеток, экспрессирующих CD4, методом сепарации магнитными частицами, как было продемонстрировано, подтвердив чистоту CD4-положительных T-клеток 95% или выше с помощью проточной цитометрии. После подсчета клеток разделите их между двумя коническими пробирками объемом 15 мл, затем промойте в теплом PBS и ресуспендируйте осадки в PBS до концентрации 20 миллионов клеток на мл.

После того как будет обеспечена защита клеток от света, окрасьте одну половину CD4-положительных Т-клеток свежеприготовленным рабочим раствором CFSE высокой концентрации до конечной концентрации 0,2 мМ, а другую половину — свежеприготовленным рабочим раствором CFSE низкой концентрации до конечной концентрации 0,04 мМ в течение 15 минут при 37 °C в 5% CO2. По окончании периода окрашивания центрифугируйте клетки и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре теплой полной среды для прекращения реакции мечения. Инкубируйте CD4-положительные Т-клетки с низким содержанием CFSE с интересующим пептидом в полной среде в конечной концентрации 5 мкг/мл в течение 45 минут в инкубаторе для клеточных культур.

После инкубации промойте обе популяции Т-клеток с высоким и низким содержанием CFSE. Дважды промойте их неполной средой и ресуспендируйте обе клеточные суспензии в неполной среде до концентрации 200 000 клеток на мл. Затем смешайте две целевые популяции в соотношении один к одному (CFSE high к CFSE low).

Теперь добавьте по 100 мкл смеси таргетных CD4-положительных Т-клеток в каждую лунку 96-луночного планшета с круглым дном, затем внесите по 1 мкл суспензии каждых CD8-положительных Т-клеток в двух повторах, чтобы конечный объем составил 200 мкл на лунку. Для измерения базового уровня апоптоза заполните три лунки только таргетными клетками, после чего инкубируйте совместную культуру в течение шести часов в инкубаторе для культур клеток. По завершении инкубации перенесите клетки в V-образный 96-луночный планшет и окрасьте каждую лунку пептидными MHC-тетрамерами, конъюгированными с PE, в течение 15 минут.

В инкубаторе для культур клеток промойте клетки раствором PBS с добавлением 2% FBS, затем, после промывки, окрасьте клетки в течение 30 минут при температуре four degrees Celsius в защищенном от света месте. Снова ресуспендируйте осадки в 100 microliters 2% формальдегида в PBS и проанализируйте клетки методом проточной цитометрии. После совместного культивирования клетки анализируют и выделяют в гейты, как показано на этих диаграммах рассеяния.

Отношение жизнеспособных целевых клеток с высоким уровнем CFSE к клеткам с низким уровнем CFSE (нестимулированным или пульсированным пептидом) анализируется с помощью небольшого гейта по параметрам forward scatter и side scatter для живых клеток; гейтирование проводится по отрицательному маркеру живых/мертвых клеток и положительному маркеру CD4, после чего T-клетки отображаются по CFSE для анализа соотношения клеток с низким уровнем CFSE к клеткам с высоким уровнем CFSE. Затем создается более широкий гейт по параметрам forward scatter и side scatter для подсчета общего количества как погибших, так и живых эффекторных и целевых клеток. После шестичасовой инкубации T-клетки, положительные по CD8 и тетрамеру, а также T-клетки, положительные по CD4 с низким уровнем CFSE, отображаются на графике для анализа соотношения эффекторных и целевых клеток.

Затем определяют общее количество эффекторных CD8+ Т-клеток, используя гейтирование по CD8-положительным и тетрамер-положительным клеткам. Общее количество таргетных клеток определяют путем гейтирования по CD4-положительным Т-клеткам, CFSE-low, а также живым и мертвым клеткам. Целевое соотношение клеток CFSE-low к клеткам CFSE-high составляет 1:1.

При культивировании таргетных клеток, положительных по CD4, в отсутствие эффекторных клеток это соотношение резко снижается. Когда клетки с низким уровнем CFSE инкубируют с общей популяцией CD8-положительных T-клеток, содержащей антигенспецифические CD8-положительные эффекторные T-клетки.

При снижении соотношения CFSE low CD4-положительные целевые клетки, пульсированные пептидом, начинают становиться положительными по маркеру живых/мертвых клеток. Разбавление эффекторных клеток приводит к восстановлению соотношения CFSE и, в конечном счете, к восстановлению числа жизнеспособных CFSE low CD4-положительных целевых Т-клеток, пульсированных пептидом. Процент специфического лизиса затем может быть построен в виде графика в зависимости от соотношения эффекторных клеток к целевым в логарифмическом масштабе. Как показано на графике, по результатам построения рассчитывается линейная регрессия, и уравнение линии тренда используется для вычисления литических единиц.

Это количество CD8-положительных эффекторных T-клеток, необходимых для уничтожения 30% из 1 миллиона таргетных CD4-положительных T-клеток, что позволяет определить внутреннюю цитолитическую активность антигенспецифических CD8-положительных T-клеток и сравнить результаты между донорами. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать цитометрию для измерения токсической активности антигенспецифических T-клеток. Этот метод также может быть легко адаптирован для вашего собственного типа T-клеток.