Изображений Клеточная мембрана Травмы и субклеточных процессов, связанных с Ремонт

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы наблюдать за эффектом желаемых методов лечения на восстановление поврежденных клеток и изучать субклеточные процессы, которые помогают в восстановлении поврежденных клеток. Это достигается путем травмирования клеток в присутствии флуоресцентных красителей, которые не могут пересекать неповрежденные клеточные мембраны, для оценки кинетики и способности поврежденных клеток предотвращать проникновение этих красителей. В качестве второго шага мы наблюдаем за появлением внутриклеточных белков на поврежденной клеточной мембране, что определяет способность представляющего интерес клеточного компартмента участвовать в репарации путем слияния с поврежденной клеточной мембраной.

Затем мы контролируем слияние представляющих интерес клеточных компартментов с поврежденной клеточной мембраной, чтобы контролировать кинетику повреждения. Получены результаты триггерного слияния этого компартмента, которые показывают, что восстановление повреждения клеточной мембраны связано с лизосомальным экзоцитозом, основанным на повышенном появлении белка лизосомы, ассоциированного с мембраной, одного на поверхности поврежденной клетки, и визуализацией секреции лизосомального содержимого поврежденными клетками в реальном времени. Эти методы могут помочь решить важные вопросы в области повреждения и восстановления клеток.

Например, они могут быть использованы для определения того, какие белки и клеточные компартменты реагируют на очаговые повреждения на клеточной мембране, а затем для оценки их кинетики ответа. Демонстрацию процедуры должны были продемонстрировать Аурелия Д. 4 и Хамма Стра двое из постдокторантов из моей лаборатории. Отдельно отметить поврежденные клетки, которые заживают, и те, которые не заживают.

Засейте клетки на стерильных покровных листах для трех экспериментальных условий. Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут конфлюенции более 50%, затем дважды промойте C 1 и C 2 с помощью CIM при 37 градусах Цельсия. Промойте C3 с PBS при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем переложите покровные стекла на силиконовые уплотнительные кольца. Добавьте 100 микролитров подогретого раствора декстрана в соответствующий буфер. Повредите плазматическую мембрану на C1 и C3, добавив 40 миллиграммов стеклянных шариков поверх защитного стекла при комнатной температуре и вручную наклонив крышку.

Скользит вперед и назад от шести до восьми раз под углом 30 градусов для легкой травмы. Убедитесь, что стеклянные шарики распределены равномерно, тем самым сводя к минимуму повторные травмы и улучшая воспроизводимость повреждений между образцами. Одновременно выполняйте повреждение стеклянных бусин различных сравниваемых образцов, избегая дальнейшего скатывания бусин.

Перенесите все крышки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия при температуре CO2 при температуре окружающей среды CO2 и дайте продолжить ремонт в течение пяти минут, не давая шарикам скатиться. Удалите стеклянные шарики и фитзи декстран, промыв буфером или PBS. Теперь поместите крышку обратно на уплотнительное кольцо и добавьте 100 микролитров предварительно подогретого лизина.

Стационарный раствор трисси декстрана Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут при температуре окружающей среды CO2. Дважды промыть крышку с помощью предварительно подогретого CIM и зафиксировать 4% PFA в течение 10 минут при комнатной температуре после двух стирок PBS. Инкубируйте в течение двух минут в красителе Hersch и после двух промывок PBS установите образец на предметное стекло с помощью монтажного материала.

Затем визуализируйте клетки с помощью эпифлуоресцентного микроскопа из образца C two. Определите интенсивность окрашивания красным и зеленым фоном. Затем используйте это значение для порогового значения красного и зеленого каналов для всех образцов.

Оцените общее количество ячеек, выделенных зеленым цветом. Также оцените ячейки, которые выделены красным или красным и зеленым цветом в образцах C one и C3. Теперь подсчитайте более 100 зеленых поврежденных клеток для каждого состояния и выразите долю клеток, которые не смогли восстановиться, в процентах от всех поврежденных клеток.

Промойте клетки, выращенные до уровня более 50%Confluence, с помощью предварительно предупрежденного CIM и закрепите защитное стекло в CIM с помощью FM-красителя. В держателе в верхней части сцены инкубатор поддерживается на уровне 37 градусов по Цельсию. Выберите область клеточной мембраны с использованием оптимальной мощности, которая позволяет наносить последовательные, но не смертельные травмы.

Для этого облучайте образец импульсным лазером менее чем на 10 миллисекунд. Уменьшите мощность лазера с помощью программного обеспечения до 40-50% от пиковой мощности для мониторинга, восстановления, получения изображений каждые две-10 секунд в эпи-, флуоресцентном и светлом поле, начиная до травмы и продолжая в течение трех-пяти минут после травмы. Чтобы количественно оценить кинетику репарации, измерьте флуоресценцию клеточного FM-красителя.

Рассчитайте изменение интенсивности в процессе визуализации. Усредните данные для более чем 10 ячеек в каждом условии и отобразите график в виде усредненных значений или значений отдельных ячеек. Промойте крышки С один и С два.

Культуральные препараты с КИМ при 37 градусах Цельсия и промывка С3 с ПБС при 37 градусах Цельсия. Затем перенесите образцы на силиконовые уплотнительные кольца. Добавьте 100 микролитров предварительно подогретого лизина, который можно закрепить трисси декстран.

Повредите плазматическую мембрану на С-1 и С3, как показано ранее. Затем избегайте дальнейшего скатывания бусин. Перенесите все крышки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия при температуре CO2 и дайте продолжить ремонт в течение пяти минут.

Теперь, чтобы удалить стеклянные шарики и Трикси декстран, промойте покровные стекла в холодной питательной среде, следя за тем, чтобы стеклянные шарики не скатывались по ячейкам. Дважды промойте покровные стекла холодной средой для роста и переложите на уплотнительные кольца на C one и C3. Добавьте 100 микролитров антитела крысы против США в холодную полную питательную среду и добавьте холодную полную питательную среду к C 2, чтобы обеспечить связывание антител. Инкубируйте крышку в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия после трех стирок холодным CIM.

Зафиксируйте все крышки 4% PFA на 10 минут при комнатной температуре. Затем трижды промыть с помощью CIM. Далее инкубируйте все покровные стекла в 100 микролитрах блокирующего раствора в течение 15 минут, затем 100 микролитров овора, 4 88 антител против крысы в течение 15 минут.

Дважды постирайте PBS и выдержите в ее пятне две минуты при комнатной температуре после двух стирок PBS. Закрепите образцы на предметном стекле, затем получите изображение образцов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с использованием изображений С-2-клеток. Определите неспецифическое фоновое окрашивание в красном и зеленом каналах.

Используйте эти значения фонового окрашивания для порогового значения красного и зеленого каналов для всех образцов. Используйте более 100 помеченных красным цветом клеток из C one и C3 для измерения интенсивности окрашивания lam one в поврежденных клетках. В успешном эксперименте окрашивание клеток из С3 будет значительно ниже, чем в клетках из С1, для мечения лизосом флуоресцентным красителем инкубирует клетки, выращенные до 50% в питательных средах, содержащих фитзи декстран.

Дайте дестрану побыть эндоцитозой в течение двух часов в инкубаторе для клеточных культур. Промойте клетки с помощью подогретой питательной среды и инкубируйте в ней в течение двух часов в CO2-инкубаторе, чтобы дать возможность всем декстранам эндоцитозы накопиться в лизосоме перед визуализацией. Промойте чехол в Prewarm CIM и установите в CIM на держатель чехла в инкубаторе на сцене при температуре 37 градусов Цельсия.

Выбирайте для клеток, которые не имеют переполненных лизосом, меченных декстраном, для визуализации. Движение и экзоцитоз отдельных лизосом. Получение изображений с широким полем для движения лизосом по всей клетке.

Поочередно получайте изображения газона для перемещения по поверхности клеток и для мониторинга их экзоцитоза. Повреждайте клеточную мембрану облучением, как было показано ранее, чтобы контролировать реакцию лизосомы на изображение повреждения клеток со скоростью от четырех до шести кадров в секунду в течение не менее двух минут или дольше, в зависимости от динамики экзоцитоза в представляющих интерес клетках. В этом объемном анализе все поврежденные клетки маркируются, а те, которые не смогли восстановиться, идентифицируются, в то время как неповрежденные клетки остаются непомеченными.

Клетки, поврежденные стеклянными шариками в присутствии фитзи декстрана, помечаются зеленым цветом, когда клеткам позволяют восстанавливаться в присутствии кальция. Большинству поврежденных клеток удается восстановиться, и они не помечаются трисси декстраном, когда клетки восстанавливаются. В отсутствие кальция большинство поврежденных клеток также помечаются красным цветом трисси декстраном.

В этом эксперименте оценивается кинетика восстановления клеточной мембраны путем мониторинга поступления FM-красителя в клетку. При инкубации в FM неповрежденные клетки практически не демонстрируют внутриклеточного окрашивания. После локализованного лазерного повреждения клеточной мембраны FM D начинает проникать в клетку и связывать эндомембраны, что вызывает внезапное увеличение флуоресценции FM-красителя, поскольку способность клеточной мембраны к восстановлению после лазерного повреждения зависит от кальция.

Поврежденная клетка в присутствии кальция способна к восстановлению, что приводит к прекращению поступления красителя FM в течение минуты после травмы. Напротив, клетка, которой позволено восстанавливаться в отсутствие кальция, не восстанавливается, что приводит к непрерывному поступлению красителя и, следовательно, к постоянному увеличению флуоресценции FM d даже через четыре минуты после травмы. Таким образом, репарация клеточной мембраны приводит к стабилизации окрашивания FM-красителя.

В то время как отсутствие восстановления клеточной мембраны приводит к постоянному поступлению красителя, которое не выходит на плато. Подход с использованием массивных стеклянных шариков может быть использован для мониторинга транслокации везикул и белков на клеточной поверхности в ответ на повреждение. Здесь клетки травмируются в присутствии трисси декстрана.

Таким образом, в то время как неповрежденные клетки не помечаются красным цветом, все поврежденные клетки помечаются красным цветом. Обратите внимание, что неповрежденные клетки, которые не обрабатываются первичным антителом, имеют фоновый уровень маркировки для лампы поверхности клетки. Однако, когда клетки повреждаются и им дают возможность заживать в присутствии кальция, лизосомы подвергаются экзоцитозу, и, таким образом, происходит повышенный уровень окрашивания на поверхности поврежденных клеток.

Это увеличение количества ламп на одной маркировке клеточной поверхности значительно ниже в клетках, которым позволено заживать в отсутствие кальция. При этом осуществляется как количественное определение количества ячеек с одним окрашиванием лампы с высокой поверхностью ячейки, так и измерение уровня поверхности ячейки лампы. Один. Окрашивание отдельных поврежденных клеток позволяет измерить способность клетки претерпевать повреждение лизосомального экзоцитоза, вызванного его повреждением.

В этом эксперименте непосредственно отслеживается кинетика, природа и место слияния отдельных лизосом. В ответ на повреждение клеточной мембраны клетки повреждаются импульсным лазером, а лизосомы клеточной поверхности визуализируются с помощью визуализации, которая позволяет контролировать вызванный повреждением экзоцитоз лизосом в отдельных клетках. На этом рисунке показана клетка, которая визуализируется с помощью фазово-контрастной визуализации на левой панели и микроскопии газона на средней панели.

На правой панели показано изображение газона той же клетки через 105 секунд после травмы. Здесь показано, что повреждение вызвало рекрутирование лизосомы к клеточной мембране с последующим экзоцитозом. Эта лизосома не видна на изображении газона до травмы, но после травмы лизосома достигает клеточной мембраны и становится обнаруживаемой.

По мере того, как везикула приближается к клеточной мембране, она лучше возбуждается освещением газона, в результате чего флуоресценция лизосомальной фитси декс нити достигает максимального значения. Когда фьюжн-лить открывается, это приводит к нейтрализации лизосомального pH и, таким образом, к гашению флуоресценции флюоресценции нити DExT. Впоследствии цепь DExT высвобождается из везикулы наружу клетки, в результате чего флуоресценция ZI распространяется в поперечном направлении, а флуоресценция везикулы постепенно уменьшает различные реакции лизосом, вызванные повреждением.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как контролировать способность клеток восстанавливаться после крупных очаговых повреждений и контролировать субклеточные компартменты и белки, которые реагируют на процесс восстановления и помогают в нем. Дальнейший эксперимент с использованием различных меток жизненно важной маркировки, компартментов или белков может быть проведен с целью мониторинга реакции на повреждение и участия в восстановлении клеток IND.