Сбор и анализ Arabidopsis Флоэма экссудата Использование ЭДТА способствовал метод

Общая цель этой процедуры заключается в сборе экссудата флома из арабидопсиса или других растений для анализа его содержания или подтверждения наличия соединений в потоке флома. Это достигается путем предварительного срезания и инкубации лепестка в ЭДТА калия, чтобы предотвратить запечатывание морского элемента. Вторым шагом является тщательная промывка лепестка, чтобы удалить любые остатки ЭДТА, которые могут помешать последующему анализу, а также повредить клетки при длительном воздействии.

Далее проточные ЭМ экссудаты собираются в воду. Ее завершающим этапом является подготовка образцов для последующего анализа с помощью геля L-C-M-S-G-C-M-S, электрофореза и тонкослойной хроматографии. В конечном счете, экссудация фама, облегченная ЭДТА, может быть использована для анализа и подтверждения содержания фемов, таких как метаболиты и липиды, белки или РНК.

Растения не могут избежать неблагоприятных условий. В результате им требуются очень эффективные и быстрые системы для передачи сигналов окружающей среды по всем предприятиям и реагирования на изменения в развитии. Одним из таких сигнальных путей является растительный поток, состав которого довольно сложен для понимания.

Мы используем облегченную седацию потока EDTA для сбора и анализа содержимого потока. Первоначально он был выведен в Perilla королем и может быть легко модифицирован для других видов. Демонстрировать процедуру будут Елена и США, обе студенты бакалавриата из моей лаборатории до начала этой процедуры.

Выращивание арабидопсиса планируется в течение четырех-шести недель в камерах выращивания с 12-часовым периодом фотосъемки в день сбора. Разбавляют предварительно приготовленный 100 миллимолярный раствор калия ЭДТА водой до получения конечной концентрации 20 миллимоляров. Затем заполните две стеклянные посуды диаметром от семи до 15 сантиметров наполовину раствором калия ЭДТА с концентрацией 20 миллимоляров.

Когда закончите, заполните 1,7 миллилитровые реакционные пробирки 1,4 миллилитрами 20 миллимолярного раствора калия ЭДТА. Затем заполните равное количество реакционных пробирок 1,4 миллилитрами многопоровой воды. После удаления четырех-шестинедельных растений из камер роста соберите листья розетки, срезав их лезвием бритвы у основания лепестка ближе к центру розетки.

Немедленно поместите листья в посуду, содержащую 20 миллимоляров калия ЭДТА, с отрезанным концом пеоли, погруженным в раствор. После того, как с трех-четырех растений будет собрано 15 листьев, аккуратно сложите их друг на друга так, чтобы срезанные лепестки были выровнены друг с другом. Срежьте основание лепестков и аккуратно скатайте листья.

После этого аккуратно вставьте свернутые листья в одну из реакционных пробирок, содержащую 20 миллимолярных калий ЭДТА для сбора экссудата. В темной линии выкладываем дно большой неглубокой посуды с мокрыми бумажными полотенцами. Поместите решетку с заполненными листьями реакционными трубками в чашку и поместите ее в черный полиэтиленовый пакет с прорезями для аэрации.

Затем поместите всю установку в шкаф для сбора экссудата. На светлую линию выкладывайте дно прозрачной емкости из плексигласа с влажными бумажными полотенцами. Поместите решетку с заполненными листьями реакционными пробирками в контейнер и закройте его.

После извлечения решетки из контейнера, через час, выньте листья из реакционных пробирок. Тщательно промойте листья дистиллированной водой, чтобы удалить все ЭДТА. Немедленно переложите листья в реакционные пробирки, содержащие многопоровую воду, и верните их в увлажненные контейнеры для сбора экссудата после извлечения решетки из увлажненного контейнера.

Через пять-восемь часов достаньте листья из трубочек, затем заморозьте выделенные жидкости в жидком азоте и храните их в морозильной камере при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для дальнейшего анализа на следующий день разморозьте образцы, готовясь к анализу липидов. Затем вытащите два-три образца и добавьте в объединенный раствор равное количество хлороформа и метанола.

смесь в течение нескольких секунд. Далее центрифугируйте образец в течение четырех минут при 400 g. По окончании соберите нижнюю органическую фазу в стеклянную пробирку, повторив перегородку с верхней фазой, еще три раза, высушите объединенные органические фазы под потоком азота и подвергните тонкослойной хроматографии и LCMS анализу.

Этот метод позволяет собрать достаточное количество экссудата для идентификации локализованных белков и изменений их уровня в ответ на развитие или стресс. В некоторых случаях исследователи могут захотеть использовать ингибиторы протеиназ для предотвращения деградации белков. Как показано на рисунке, белки находятся в очень низком количестве, но их уровень достаточно высок для последующих экспериментов по протеомике.

Использование LCMS или для анализа вестерн-блоттинга позволяет предположить, что разрезание STEM приводит к нарушению баланса водного потенциала и последующему притоку воды и возможных загрязняющих веществ из пласта. Однако сбор в течение времени от одного до восьми часов не влияет на профиль и состав протока М-белка InOpSys. Количество собранного белка и структура обнаруженных белков варьируются в зависимости от вида и лечения.

В результате белковые сигналы могут быть визуализированы, идентифицированы и отслеживаться. МРНК и микроРНК также могут быть идентифицированы в экссудатах флом с помощью этого метода. Тем не менее, лечение ингибиторами РНК необходимо для предотвращения деградации МР. НК в течение увеличенного времени экссудации.

Поскольку С-элементы не содержат функциональных хлоропластов, рубис, малые или большие субъединицные мРНК могут быть использованы в качестве отрицательного контроля, в то время как известные рН-локализованные мРНК, такие как убиквитин-конъюгирующий фермент, могут быть использованы в качестве положительного контроля. Аналогичным образом, сахара или небольшие метаболиты могут быть проанализированы с помощью GCMS или LCMS. Следует упомянуть, что экссудаты phem содержат большое количество функциональных ферментов, включая практически весь гликолитический путь.

Следовательно, использование нескольких временных точек может выявить метаболические процессы во время сбора экссудата. Среди всех экссудатов сахароза является наиболее распространенным метаболитом. Наиболее очевидно это после сбора в течение часа.

Однако через пять часов соотношение сахарозы и фруктозы немного снижается. Если тот же экссудат собрать на один час, а затем оставить на стенде еще на четыре часа, то соотношение сахарозы и фруктозы снижается в гораздо большей степени. Можно предположить, что активные ферменты в экссудате phem приводят к деградации сахарозы при комнатной температуре.

Кроме того, тот факт, что непрерывный сбор в течение пяти часов показывает лишь незначительное снижение соотношения сахарозы и фруктозы, согласуется с выводами о том, что загрузка и транспортировка молекул из клеток-компаньонов в морские элементы могут продолжаться во время экссудации до тех пор, пока система не потеряет свою жизнеспособность. Липиды в экссудатах и, как следствие, передача липидов на большие расстояния являются довольно новой областью интереса в науке о растениях. Из-за своей гидрофобной природы липиды присутствуют только в низких концентрациях и могут связываться с другими молекулами для солюбилизации.

Тем не менее, облегченная экссудация EDTA позволяет собрать достаточно материала для визуализации и идентификации потока и липидов нескольких видов растений. Как показано здесь, можно разделить несколько видов липидов с помощью тонкослойной хроматографии. LCMS позволяет идентифицировать различные виды липидов и отслеживать изменения в липидных профилях различных генотипов или методов лечения.

Это позволяет изучать роль липидов в развитии растений и реакции на стресс. Как только вы освоите эту технику, ее можно выполнять уже за три часа, если она выполнена правильно. Тем не менее, для большинства образцов мы бы предложили время сбора от пяти до восьми часов.

В этом случае рекомендуется раннее утреннее начало сбора урожая листьев. Эта процедура может быть модифицирована для других растений и может привести к открытию или подтверждению новых соединений потока. При проведении этой процедуры важно помнить о тщательном контроле PDL после первого часа, чтобы удалить ЭДТА, и не сдавливать листья, чтобы предотвратить загрязнение содержимым других клеток.

Кроме того, ношение перчаток также защищает образцы от загрязнений, которые вы можете занести с кожи Чтобы предотвратить загрязнение, используйте соответствующие средства контроля для образцов белковой РНК или метаболитов. Предлагаемые элементы управления перечислены в текстовом протоколе. Этот метод позволил нам по-новому взглянуть на состав растительного потока.

Нам удалось идентифицировать несколько липидов в форме экссудата, которые не ожидались в водной среде пола. Это привело нас и других ученых к введению концепции передачи липидной сигнализации на большие расстояния, которая в настоящее время превратилась в новые захватывающие исследования в области имплантатов.