Сбор и анализ
23 октября 2013 г.
Знание состава флоэмы SAP, а также механизм ее транспортной нагрузки и междугородной имеет важное значение для понимания дальней сигнализации в развитии завода и стресс / патоген ответ и ассимилировать транспорта. Эта рукопись описывает набор экссудаты флоэмы использованием ЭДТА способствует методом.
Общая цель данной процедуры заключается в сборе флоэмного экссудата из Arabidopsis или других растений для анализа его состава или подтверждения наличия определенных соединений в потоке флоэмы. Это достигается путем предварительного срезания и инкубации лепестка в растворе ЭДТА калия для предотвращения закупоривания ситовидных элементов. Вторым этапом является тщательная промывка лепестка для удаления остатков ЭДТА, который может помешать последующему анализу, а также вызвать повреждение клеток при длительном воздействии.
Затем экссудаты, выходящие из потока EM, собирают в воду. Последним этапом является подготовка образцов для последующего анализа с помощью L-C-M-S-G-C-M-S геля, электрофореза и тонкослойной хроматографии. В конечном итоге, облегченное ЭДТА выведение экссудатов может быть использовано для анализа и подтверждения содержания таких компонентов, как метаболиты и липиды, белки или РНК.
Растения не могут избежать воздействия неблагоприятных условий. В результате им необходимы очень эффективные и быстрые системы передачи сигналов об окружающей среде по всему растению и ответная реакция в виде изменения развития. Одним из таких сигнальных путей является растительный ток, состав которого довольно сложно понять.
Для сбора и анализа содержимого протоков мы используем метод седации с применением ЭДТА (EDTA facilitated flow sedation). Этот метод был первоначально разработан для Perilla компанией king, но может быть легко адаптирован для других видов. Демонстрировать процедуру будут Елена и US, оба студента моего курса, которые прошли предварительную подготовку перед началом выполнения данной процедуры.
Выращивайте растения Arabidopsis в течение четырех-шести недель в климатических камерах с 12-часовым фотопериодом до дня сбора. Разбавьте предварительно приготовленный 100 мМ раствор ЭДТА калия водой до конечной концентрации 20 мМ. Затем наполните две стеклянные чашки диаметром от 7 до 15 см наполовину 20 мМ раствором ЭДТА калия.
По завершении наполните реакционные пробирки объемом 1,7 мл 1,4 мл 20 мМ раствора ЭДТА калия. Затем наполните такое же количество реакционных пробирок 1,4 мл воды Millipore. После извлечения растений в возрасте от четырех до шести недель из камер выращивания соберите листья розетки, срезав их лезвием бритвы у основания лепестка близко к центру розетки.
Немедленно поместите листья в чашки, содержащие 20 millimolar ЭДТА калия, погрузив срезанный конец черешка в раствор. После сбора 15 листьев с трех-четырех растений аккуратно сложите их друг на друга так, чтобы срезанные края были выровнены. Повторно обрежьте основания листьев и аккуратно сверните их в рулон.
После этого осторожно поместите свернутые листья в одну из реакционных пробирок, содержащих 20 миллимолярный раствор ЭДТА калия, для сбора экссудата. В темноте выстелите дно большой неглубокой чашки влажными бумажными полотенцами. Поместите штатив с реакционными пробирками, содержащими листья, в чашку, а затем положите её в черный пластиковый пакет с прорезями для аэрации.
Затем поместите всю установку в шкаф для сбора экссудата. Выстелите дно прозрачного контейнера из плексигласа влажными бумажными полотенцами. Поместите штатив с реакционными пробирками, содержащими листья, в контейнер и закройте его.
Спустя один час после извлечения штатива из контейнера извлеките листья из реакционных пробирок. Тщательно промойте листья дистиллированной водой, чтобы полностью удалить ЭДТА. Немедленно перенесите листья в реакционные пробирки с водой Millipore и поместите их обратно в увлажненные контейнеры для сбора экссудатов после извлечения штатива из увлажненного контейнера.
Через пять-восемь часов извлеките листья из пробирок, затем заморозьте экссудаты потока в жидком азоте и поместите их в морозильную камеру при температуре -80 °C. Для дальнейшего анализа на следующий день разморозьте образцы в preparation к анализу липидов. Затем возьмите два-три образца и добавьте равное количество хлороформа и метанола к объединенному раствору.
Перемешайте смесь на вортексе в течение нескольких секунд. Затем центрифугируйте образец в течение четырех минут при 400 gs. По завершении соберите нижнюю органическую фазу в стеклянную пробирку, повторив разделение с верхней фазой еще трижды; высушите объединенные органические фазы в потоке азота и подвергните их анализу методом тонкослойной хроматографии и ЖХ-МС.
Данный метод позволяет собрать достаточное количество экссудатов флоэмы для идентификации белков, локализованных в флоэме, и анализа изменений их уровня в ответ на развитие или стресс. В некоторых случаях исследователям может потребоваться использование ингибиторов протеиназ для предотвращения деградации белков. Как показано здесь, содержание белков очень низкое, однако их уровень достаточно высок для проведения последующих протеомных экспериментов.
Данные анализа методом LCMS или вестерн-блоттинга, полученные для тыквенных, позволяют предположить, что срезание стебля приводит к нарушению баланса водного потенциала и последующему притоку воды и возможных загрязнителей из окружающей среды. Однако время сбора в диапазоне от одного до восьми часов не влияет на профиль и состав белков в системе InOpSys. Количество собранного белка и набор обнаруженных белков варьируют в зависимости от вида растений и условий обработки.
В результате становится возможной визуализация, идентификация и отслеживание белковых сигналов. Этим методом также можно идентифицировать мРНК и микроРНК в экссудатах цветка. Однако для предотвращения деградации мРНК в течение длительного времени экссудации необходима обработка ингибиторами РНКаз.
Поскольку элементы C не содержат функциональных хлоропластов, мРНК rubis, малой или большой субъединицы могут быть использованы в качестве отрицательного контроля, в то время как известная локализованная мРНК pH flu m, такая как убиквитин-конъюгирующая фермент, может быть использована в качестве положительного контроля. Аналогичным образом, сахара или малые метаболиты можно анализировать с помощью ГХ-МС или ЖХ-МС. Следует отметить, что экссудаты phem содержат большое количество функциональных ферментов, включая почти весь путь гликолиза.
Следовательно, использование нескольких временных точек может выявить метаболические процессы во время сбора экссудата. Во всех экссудатах сахароза является наиболее распространенным метаболитом. Это наиболее заметно после сбора в течение одного часа.
Тем не менее через пять часов соотношение сахарозы к фруктозе несколько снижается. Если тот же экссудат собирать в течение одного часа, а затем оставить на столе еще на четыре часа, соотношение сахарозы к фруктозе снижается значительно сильнее. Это позволяет предположить, что активные ферменты в экссудатах флоэмы приводят к деградации сахарозы при комнатной температуре.
Кроме того, тот факт, что непрерывный сбор в течение пяти часов демонстрирует лишь незначительное снижение соотношения сахарозы к фруктозе, согласуется с данными о том, что нагрузка флоэмы и транспорт молекул из клеток-спутников в ситовидные элементы могут продолжаться во время экссудации до тех пор, пока система не утратит свою жизнеспособность. Липиды в экссудатах флоэмы и, следовательно, дальняя липидная сигнализация являются достаточно новой областью интереса в науке о растениях. Из-за своей гидрофобной природы липиды присутствуют лишь в низких концентрациях и могут быть связаны с другими молекулами для обеспечения растворимости.
Тем не менее, экссудация, облегчаемая ЭДТА, позволяет собрать достаточное количество материала для визуализации и идентификации потоков и липидов нескольких видов растений. Как показано здесь, с помощью тонкослойной хроматографии можно разделить несколько видов липидов. LCMS позволяет идентифицировать различные виды липидов и отслеживать изменения в липидных профилях различных генотипов или вариантов обработки.
Это позволяет изучать роль липидов в процессе развития растений и их реакции на стресс. После освоения данной методики процедура может занять всего три часа при условии ее правильного выполнения. Однако для большинства образцов мы рекомендуем время сбора от пяти до восьми часов.
В данном случае рекомендуется начинать сбор листьев рано утром. Эту процедуру можно модифицировать для других растений, что может привести к обнаружению или подтверждению новых соединений флоры. При выполнении данной процедуры важно тщательно следить за PDL после первого часа, чтобы удалить EDTA, а также не сжимать листья, чтобы предотвратить загрязнение содержимым других клеток.
Кроме того, использование перчаток защищает ваши образцы от загрязнений, которые могут попасть с кожи. Чтобы предотвратить контаминацию, используйте соответствующие контроли для образцов белков, РНК или метаболитов. Рекомендуемые контроли перечислены в текстовом протоколе. Данный метод позволил нам получить новые сведения о составе растительного флоу.
Нам удалось идентифицировать в экссудате несколько липидов, присутствие которых в водной среде дна было неожиданным. Это побудило нас и других исследователей ввести концепцию дальнего липидного сигналинга, которая в настоящее время переросла в захватывающую новую область исследований имплантатов.
Обзор
В данном исследовании описывается метод сбора экссудатов флоэмы растений, в частности Arabidopsis, с использованием подхода с применением ЭДТА. Понимание состава флоэмного сока имеет решающее значение для изучения сигнальных путей растений и их реакций на воздействие факторов окружающей среды.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология растений
- Механизмы транспорта в флоэме
- Анализ метаболитов
Теоретическая часть
- Флоемный сок играет важную роль в передаче сигналов на большие расстояния в растениях.
- Эффективный транспорт питательных веществ и сигналов необходим для развития растений.
- Метод с использованием ЭДТА позволяет эффективно собирать экссудаты флоемы.
- Понимание состава флоемы помогает изучать реакции растений на стресс и патогены.
Цель исследования
- Сбор и анализ экссудатов флоэмы Arabidopsis и других растений.
- Подтверждение наличия метаболитов, белков и РНК в соке флоэмы.
- Исследование сигнальных путей, участвующих в реакциях растений на условия окружающей среды.
Используемые методы
- Инкубация лепестков растений в растворе ЭДТА калия для предотвращения закупорки ситовидных элементов.
- Сбор экссудатов флоэмы в реакционные пробирки для последующего анализа.
- Использование жидкостного хромато-масс-спектрометра (LC-MS), газового хромато-масс-спектрометра (GC-MS) и тонкослойной хроматографии для анализа метаболитов.
- Замораживание и размораживание образцов для дальнейшего анализа белков и РНК.
Основные результаты
- Успешный сбор экссудатов флоэмы в количестве, достаточном для проведения протеомных и метаболомных исследований.
- Идентификация белков и метаболитов, включая сахарозу в качестве наиболее распространенного метаболита.
- Демонстрация применимости данного метода для различных видов растений.
- Получение данных о динамике состава флоэмы в ответ на условия развития и стрессовые факторы.
Выводы
- Метод с использованием ЭДТА эффективен для изучения экссудатов флоэмы.
- Анализ флоэмного сока позволяет получить важную информацию о сигнальных путях и метаболизме растений.
- Данный подход может быть адаптирован для различных видов растений с целью более глубокого понимания функций флоэмы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание состава флоэмы позволяет снизить механические риски при валидации мишеней для применения в области растительной биофармацевтики, особенно при анализе метаболитов и сигнальных путей. Метод получения экссудата с помощью ЭДТА повышает прогностическую уверенность, обеспечивая воспроизводимый доступ к содержимому флоэмы у различных видов, что способствует оптимизации рабочих процессов на ранних этапах поиска. Данный подход улучшает трансляционную непрерывность — от этапа открытия до доклинической оценки соединений растительного происхождения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем анализа локализованных в флоеме метаболитов, белков и РНК, участвующих в путях передачи стрессовых сигналов.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет функциональной валидации мишеней с использованием профилей сахарозы, липидов и белков в качестве биомаркеров целостности и активности флоемы.
- Прогностическая ценность: облегчает отбор проектов в портфеле путем установления связи между изменениями состава флоемы и условиями развития или стресса, что позволяет принимать решения о продолжении или прекращении скрининга соединений на растительных моделях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет подготавливать валидированные биологические системы для последующих этапов анализа путем получения экссудатов, пригодных для ЖХ-МС, ГХ-МС и тонкослойной хроматографии при исследовании метаболитов и липидов.
- Практическая ценность: Повышает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет контролируемого времени сбора экссудатов и этапов удаления EDTA, что снижает вариативность результатов при скрининге соединений.
- Масштабируемость: Обеспечивает надежную оценку соединений для травянистых и древесных видов при использовании минимального оборудования, что позволяет повторно использовать платформу в исследовательских процессах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Рассматривается значимость для изучения заболеваний посредством анализа липидной сигнализации и гликолитических ферментов в экссудатах флоэмы, что соответствует задачам поиска трансляционных биомаркеров стрессовых реакций растений.
- Практическая ценность: Описывает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, обеспечивая возможность лонгитюдного профилирования метаболитов и белков флоэмы в различные временные точки и при разных вариантах обработки.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения по дальнейшей разработке соединений растительного происхождения путем идентификации стабильных биомаркеров (например, соотношений сахарозы), которые отражают жизнеспособность процессов загрузки и транспорта во флоэме.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум открытий — от проверки гипотез до идентификации ведущих соединений, обеспечивая анализ метаболитов, белков и липидов, полученных из флоэмы Arabidopsis и других видов.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению метаболических путей, позволяя анализировать локализованные в флоэме соединения, участвующие в передаче сигналов стресса и метаболическом потоке.
- Скрининг: описывает готовность анализа за счет стандартизированных этапов сбора и очистки экссудата, что обеспечивает воспроизводимые количественные результаты при скрининге метаболитов и липидов.
- Аналитика: выделяет ВЭЖХ-МС, ГХ-МС и тонкослойную хроматографию в качестве ключевых аналитических методов, позволяющих получать сопоставимые наборы данных для оценки влияния соединений на состав флоэмы.
- Трансляционные исследования: связывает метод с преклинической преемственностью, позволяя отслеживать липидные и белковые биомаркеры в различных условиях развития и стресса, что способствует обоснованному продвижению исследований с учетом рисков.
- Корпоративное использование: позиционирует метод с применением ЭДТА как универсальный инструмент, применимый для различных видов растений и лабораторий, что снижает зависимость от специализированного оборудования для анализа флоэмы.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при валидации мишеней, устранение неоднозначности в механизмах сигнальных путей флоэмы и поиск биомаркеров стрессового ответа.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость сбора экссудатов для различных видов растений и лабораторных условий.
- Стратегическая ценность: Обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), повышение эффективности использования капитала за счет снижения процента неудач на поздних стадиях разработки соединений растительного происхождения, а также снижение биологических рисков при выборе мишеней.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных профилей метаболитов и белков флоэмы.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области физиологии растений и анализа метаболитов для дифференциации истинных экссудатов флоэмы от клеточных загрязнений.
- Зависит от наличия доступа к оборудованию для ЖХ-МС, ГХ-МС и электрофореза для всесторонней характеристики экссудатов.
- Необходима межлабораторная стандартизация протоколов промывки ЭДТА и времени сбора для обеспечения воспроизводимости результатов.
- При применении метода к древесным видам в отличие от травянистых требуются корректировки с учетом различий в кинетике заживления флоэмы.
- Практическое ограничение: возможно только относительное количественное определение, так как метод основан на экссудации, а не на прямом сборе сока флоэмы, что требует стратегий нормализации для сравнения образцов.
