Устройство и принцип действия непрерывного

Общая цель данной процедуры — получение растительного материала с высоким уровнем обогащения углеродом 13 и азотом 15, распределенным равномерно по всему растению или дифференциально в структурных и метаболических тканях. Это достигается путем предварительного создания герметичной камеры для выращивания растений. Вторым этапом является контроль температуры, влажности и уровней углекислого газа в камере для поддержания подходящих условий роста растений.

Затем растения выращивают в герметичной камере с воздухом, содержащим 13C, диоксидом углерода, а также в условиях полива и внесения удобрений, содержащих азот 15. Заключительным этапом является прекращение маркировки путем извлечения дифференциально маркированных растений из камеры за несколько недель до сбора урожая, чтобы их метаболический материал стал менее обогащенным углеродом 13 и азотом 15. Для измерения общего уровня изотопной маркировки и разницы в интенсивности маркировки по сравнению со структурными компонентами растений после сбора растительного материала используют экстракцию горячей водой и изотопную масс-спектрометрию.

Основным преимуществом непрерывного мечения перед другими методами, такими как листовая обработка или повторное импульсное мечение, является получение равномерно меченого растительного материала, в котором метаболические или структурные компоненты могут быть мечены дифференциально. Для начала данной процедуры сконструируйте мечения камеру, как описано в прилагаемом текстовом протоколе: установите прозрачные акриловые стенки толщиной 3.18 millimeter и прозрачный акриловый потолок толщиной 6.35 millimeter на алюминиевый каркас со стальным полом, выкрашенным в белый цвет; размеры камеры могут быть адаптированы под конкретные нужды выращивания растений. Камера, показанная здесь, имеет размеры 1.2 на 2.4 на 3.6 meters и вмещает 40 горшков объемом 15 liter; убедитесь в герметичности камеры, заполнив все швы соответствующим силиконовым герметиком.

Установите дверцу на машинные винты, которые можно закручивать и выкручивать с помощью съемных гаек-барашков. Уплотните дверцу уплотнителем, чтобы предотвратить утечку воздуха в области, непосредственно прилегающей к камере маркировки. Подключите центр управления к монитору и отрегулируйте температуру, влажность и уровень углекислого газа внутри камеры.

Убедитесь, что электрические провода и газовые трубки, проходящие в камеру, тщательно герметизированы силиконом для предотвращения утечки воздуха. При необходимости добавьте в камеру освещение для увеличения проникновения света и контроля продолжительности светового дня. Для регулирования температуры в камере установите промышленный кондиционер сплит-системы, при этом испарительные катушки должны находиться внутри камеры, а компрессор и конденсаторные катушки — снаружи для отвода тепла.

Затем установите в камеру небольшой бытовой осушитель воздуха. Просверлите отверстие в полу рядом с осушителем, проденьте дренажную трубку из осушителя через это отверстие в банку с водой. Это обеспечит герметичность слива и позволит выровнять давление. Регулируйте влажность в камере, подключив к осушителю программируемый контроллер (например, серии Omega iSeries) с датчиком влажности.

Затем установите инфракрасный газоанализатор или ER a с диафрагменным насосом, который непрерывно перекачивает воздух из камеры через ER A обратно в камеру. Это позволяет поддерживать закрытую систему при постоянном мониторинге концентрации углекислого газа в камере. Далее подключите два баллона с чистым углекислым газом к системе управления подачей углекислого газа.

Один из баллонов должен содержать диоксид углерода с содержанием 13C 10 атомных процентов или выше, а другой — диоксид углерода с естественным содержанием 13C. Установите регуляторы баллонов на 20 PSI, затем после регуляторов установите в газовые линии электромагнитные клапаны для управления подачей диоксида углерода с помощью программного обеспечения Ergo.

Управляйте открытием и закрытием электромагнитных клапанов, подключив их к ER rga через программу твердотельных реле. Настройте в программном обеспечении ergas нижний порог тревоги для срабатывания открытия электромагнитных клапанов при падении концентрации диоксида углерода в камере ниже определенного значения, а также зону нечувствительности (deadband) для закрытия клапанов после достижения концентрацией диоксида углерода верхней уставки. После электромагнитных клапанов установите дозирующий клапан на каждую из двух линий газовых баллонов и осторожно отрегулируйте их для достижения требуемого уровня обогащения атмосферы углеродом-13.

В данном случае мы используем обогащение углеродом 13 в концентрации 4,4 атомного процента. Соедините выпускные отверстия вместе и в конечном итоге подведите линию в центр камеры между вентиляторами, что поможет равномерно распределить меченый диоксид углерода по всей камере для настройки системы полива. Сначала создайте по одному кольцу капельного полива для каждого горшка и выведите поливочные трубки наружу через небольшое отверстие, сделанное в стенке камеры.

Затем загерметизируйте отверстия вокруг ирригационной трубки силиконовым герметиком, чтобы предотвратить утечку воздуха снаружи камеры. Подсоедините ирригационную трубку к трубке перистальтического насоса и закрепите её небольшим хомутом для шланга, чтобы избежать утечки воздуха между поливами. Перед посадкой в горшки прорастите семена для проверки их жизнеспособности, затем инокулируйте проростки свежей почвенной суспензией. Для введения полезных микробов наполните горшки безпочвенной почвосмесью, чтобы исключить попадание немаркированного углерода и азота из почвы.

Здесь мы используем смесь песка, вермикулита и пористой керамики с профилированием. После прорастания семян осторожно пересадите проростки в горшки с минимальным количеством почвосмеси. Затем поместите горшки в камеру и подключите к каждому горшку индивидуальный поливочный шланг.

Наконец, закройте дверь камеры и очистите внешний воздух от углекислого газа, подключив скруббер с содой-известью к воздушному насосу, пока концентрация углекислого газа не снизится как минимум до 200–250 ppm. Затем снова заполните камеру до 400 ppm, используя смесь из баллона с 13C-углекислым газом. Старайтесь держать камеру закрытой на протяжении всего периода вегетации, чтобы минимизировать загрязнение углекислым газом с естественным содержанием изотопов.

Сначала подготовьте раствор удобрения типа Хайленда, меченый азотом 15, смешав нитрат калия с 98 атомным процентом азота 15 и нитрат калия с азотом естественной распространенности, после чего добавьте его в остальную часть раствора Хукина. В данном случае для подкормки используется раствор с содержанием азота 15 в размере 7 атомных процентов. С помощью перистальтического насоса подавайте меченый азотом 15 раствор удобрения через ирригационные трубки.

Зафиксируйте ирригационные шланги с помощью зажимов UNC и внесите варьирующееся количество удобрений отдельным растениям в соответствии с потребностью и планом эксперимента. Затем прокачайте воду через шланги, чтобы промыть их от остатков удобрений. Общий объем добавленной жидкости не должен превышать влагоемкость горшков, чтобы минимизировать потери удобрений.

Зафиксируйте зажим, плотно затянув все шланги после проведения удобрения и полива, чтобы исключить утечку воздуха из камеры. Для дифференциального мечения структурных и метаболических компонентов извлеките растения из камеры мечения за одну-три недели до сбора урожая. Растения, которые должны быть помечены равномерно, оставляйте внутри камеры до момента сбора.

Для индукции старения просто прекратите полив, когда растения будут готовы. Соберите растения, предварительно срезав надземную биомассу.

После сбора надземной биомассы высыпьте почвосмесь и корни на сито с ячейками 6 мм, чтобы отделить корни от субстрата. Затем промойте корни через сито с ячейками 2 мм, чтобы удалить остатки почвенного материала. При необходимости используйте пинцет, чтобы удалить частицы почвосмеси, прилипшие к корням, после чего оставьте корни до полного высыхания на воздухе для использования в последующих экспериментах.

В течение трех вегетационных периодов эксплуатации в камере успешно поддерживалась температура от 26 до 29 °C, влажность от 36 до 56% и концентрация углекислого газа от 360 до 400 ppm в соответствии с параметрами, заданными в центре управления. Здесь представлены репрезентативные результаты вегетационного периода 2011 года для Andra Pogon Girard di. Накопление углекислого газа во время ночного дыхания, по-видимому, не вредит растущим растениям и быстро поглощается после восхода солнца.

Маркировка азотом-15 с использованием целевого 7 ат. % раствора азота-15 в раствор Хоглина позволила получить высокомаркированный растительный материал с содержанием азота-15 6,7 ат. %; небольшое снижение по сравнению с целевым уровнем маркировки азотом-15 может быть вызвано наличием природного азота в почвенной смеси или в результате инокуляции местной почвой. Маркировка углеродом-13 с использованием целевого 4,4 ат. % диоксида углерода 13C привела к содержанию углерода-13 4,46 ат. %. По сравнению с однородно маркированным растительным материалом, растения с дифференциальной маркировкой, которые были извлечены из камеры за 7, 14 или 22 дня до сбора урожая, имели значимые различия по содержанию углерода-13 и азота-15.

Содержание в метаболических компонентах, полученных в виде горячих водных экстрактов, и в структурных компонентах, полученных в виде остатков горячих водных экстрактов, указывает на дифференциальную маркировку метаболических и структурных растительных материалов. После своей разработки метод непрерывного двойного изотопного маркирования открыл исследователям в области биогеохимии путь к изучению судьбы и трансформации растительных компонентов в окружающей среде на макро- и наноуровне.