Многослойные Монтаж для долгосрочного Light Sheet микроскопии данио рерио
27 февраля 2014 г.
Развитие рыбок данио может следовать в течение нескольких дней с легкой листовой микроскопии, когда эмбрионы встроенных в оптически прозрачных полимерных труб с низкой концентрации агарозы.
Общая цель данной процедуры — закрепление эмбриона данио-рерио для длительной светолистовой микроскопии in vivo. Для этого сначала очищают фторированную этилен-пропиленовую трубку (FEP) и покрывают ее метилцеллюлозой. Затем наносится покрытие на исследуемый эмбрион данио-рерио.
Затем эмбрион сначала переносят в расплавленный агароз, а после — в покрытую FEP-трубку. В завершение дно трубки закрывают пробкой Aros и тщательно проверяют ориентацию закрепленного эмбриона. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие ненарушенное развитие эмбрионов zebrafish в течение нескольких дней с высоким пространственным и временным разрешением с помощью светолистowej микроскопии in vivo.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методиками является то, что теперь мы можем наблюдать за эмбрионами рыб в течение нескольких дней, а не всего нескольких часов. Этот метод позволяет получить ценные сведения о долгосрочном эмбриогенезе данио-рерио с помощью плоскостной световой микроскопии. Он также может быть применен к другим мелким организмам, например, к небольшим морским организмам.
Этот метод также может быть использован совместно с другими методами микроскопии, такими как оптическая проекционная томография, широкопольная микроскопия или конфокальная микроскопия. Лица, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с определенными трудностями, так как протокол включает несколько критических по времени этапов, а определение окончательного положения эмбриона требует определенного опыта. Для подготовки FEP-трубки сначала очистите ее, неоднократно промывая 1 M гидроксидом натрия. Затем перенесите трубку в центрифужную пробирку объемом 50 мл, заполненную 0,5 M гидроксидом натрия, и подвергните воздействию ультразвука в течение 10 минут.
Перенесите полимерную трубку в небольшой кювет с дистиллированной деионизированной водой и промойте ее. Затем промойте трубку 70% ethanol перед переносом в новую центрифужную пробирку. С ethanol ultras.
Обрабатывайте пробирку ультразвуком в течение 10 минут, после чего перенесите ее в небольшую емкость с дистиллированной деионизированной водой и промойте. Повторите процедуру. Разрежьте чистую пробирку FEB на кусочки длиной по 3 см и, при необходимости, выпрямите их. Храните очищенные фрагменты пробирок в новой пробирке объемом 50 мл, заполненной дистиллированной деионизированной водой.
Приготовьте стоковый раствор Trica. 3% раствор метилцеллюлозы, а также 1,5% и 0,1% растворы Aros приготовьте согласно текстовому протоколу. Расплавьте 1,5% агар и вылейте его в чашку Петри, чтобы сформировать слой толщиной около двух миллиметров.
Соберите эмбрионов zebrafish на нужной стадии развития, у которых наблюдается положительная экспрессия выбранного гена флуоресценции, и под стереомикроскопом перенесите их в чашку со свежим раствором E three. Используя два острых пинцета, осторожно удалите хорион: одним пинцетом зафиксируйте хорион, а вторым надрвите и снимите его для последующего многослойного монтирования. В перчатках закрепите канюлю с тупым концом на шприце.
Осторожно вставьте канюлю примерно на три миллиметра в один из концов очищенного отрезка трубки из ФЭП. Затем погрузите свободный конец трубки из ФЭП в 3% раствор метилцеллюлозы и заполните трубку этим раствором. После этого медленно нажмите на шприц, чтобы вытеснить метилцеллюлозу, используя среду E three; повторите этапы погружения и вытеснения.
Тем временем в термоблоке нагрейте одну аликвоту 0,1% aros до 70 °C. Кратковременно перемешайте реакционную пробирку на вортексе перед переносом в термоблок, установленный на 38 °C. После нагрева дайте пробирке ненадолго остыть, добавьте trica до конечной концентрации от 133 до 200 mg/L и перемешайте на вортексе.
Снова используя стеклянную пастеровскую пипетку, перенесите покрытый эмбрион в реакционную пробирку с предварительно нагретым aros, стараясь перенести как можно меньше E three. С помощью трубки из FEP и присоединенного шприца осторожно наберите небольшое количество aros, прежде чем забирать эмбрион, и полностью заполните трубку раствором aros.
Эмбрион должен быть расположен у одного из концов трубки головкой в сторону отверстия. Чтобы предотвратить вытекание содержимого, держите трубку в горизонтальном положении, чтобы перекрыть ее. Используйте лезвие бритвы, чтобы отделить его от канюли.
Затем, удерживая пробирку перпендикулярно, медленно проткните ею весь слой 1,5% агарозы и слегка поверните. Чтобы избежать высыхания, перед визуализацией храните закрепленный образец в реакционной пробирке объемом 1,5 мл, заполненной средой E3. Убедитесь, что рыба внутри трубки из FEP расположена прямо, а ее голова находится непосредственно на пробке для проведения визуализации.
Добавьте трика в среду внутри камеры для визуализации. Здесь показан трансгенный эмбрион данио-рерио K-G-R-L-G-F-P на первый день после оплодотворения; визуализация проводилась в течение двух дней для наблюдения за развитием сосудистой системы.
Данио-рерио не ограничивается фиксирующей средой и может развиваться нормально. Например, голова рыбки поднимается, хвост удлиняется, а прорастание сосудов происходит беспрепятственно.
При правильном выполнении и наличии всех необходимых материалов данная процедура занимает 10 минут. Помните о необходимости выполнять все основные этапы без задержек. Следите за чистотой всех растворов, так как загрязнения могут ухудшить качество итогового изображения.
Обзор
В данной статье описывается метод монтажа эмбрионов zebrafish для длительной микроскопии светового листа in vivo. Эта методика позволяет наблюдать за развитием zebrafish в течение нескольких дней с высоким пространственным и временным разрешением.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Данио-рерио являются модельным организмом для изучения развития позвоночных.
- Традиционные методы визуализации ограничены короткими периодами наблюдения.
- Светолистковая микроскопия обеспечивает неинвазивный способ наблюдения за живыми эмбрионами.
- Помещение эмбрионов в подходящую среду имеет решающее значение для успешной визуализации.
Цель исследования
- Разработать протокол для длительной визуализации эмбрионов zebrafish.
- Углубить понимание эмбриогенеза посредством непрерывного наблюдения.
- Получить данные, применимые к другим малым организмам.
Используемые методы
- Очистка и подготовка FEP-трубок для закрепления эмбрионов.
- Покрытие эмбрионов метилцеллюлозой и их помещение в агарозный гель.
- Использование плоскостной световой микроскопии для регистрации процессов развития.
- Обеспечение правильного позиционирования эмбрионов для получения оптимальных изображений.
Основные результаты
- Успешная длительная визуализация эмбрионов zebrafish в течение нескольких дней.
- Наблюдение за нормальными процессами развития без внесения возмущений.
- Демонстрация развития сосудистой системы у трансгенных zebrafish.
- Метод может быть адаптирован для использования с другими методами микроскопии.
Выводы
- Разработанный метод обеспечивает беспрецедентную возможность наблюдения за эмбриогенезом zebrafish.
- Он представляет собой ценный инструмент для исследователей в области биологии развития.
- В дальнейшем данные подходы могут быть применены и для других мелких водных организмов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Длительная визуализация эмбрионов zebrafish in vivo позволяет механистически снизить риски при изучении путей развития и способствует валидации мишеней на ранних этапах поиска. Данный метод многослойного монтажа обеспечивает создание релевантной с точки зрения патологии системы для наблюдения за нормальным эмбриогенезом с минимальным вмешательством, что повышает прогностическую достоверность фенотипического скрининга. Это позволяет рассматривать плоскостную микроскопию как масштабируемый и воспроизводимый инструмент для оценки доклинических моделей и сопоставления трансляционных биомаркеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством наблюдения в реальном времени за развитием сосудов и морфологией трансгенных zebrafish.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней, обеспечивая беспрепятственный эмбриогенез в течение нескольких дней, что снижает количество ложноположительных результатов при анализе сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: улучшает идентификацию перспективных соединений-лидеров за счет получения количественных лонгитюдных показателей процессов развития при воздействии исследуемых соединений.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных биологических систем в оптически прозрачных трубках из FEP для последующего скрининга соединений с единообразным позиционированием эмбрионов.
- Воспроизводимость: Стандартизация подготовки образцов с использованием низкоконцентрированного агарозы и покрытия из метилцеллюлозы, что сводит к минимуму вариабельность между повторностями.
- Масштабируемость: Возможность использования многоканальных систем визуализации благодаря быстрому 10-минутному протоколу монтажа и совместимости с автоматизированными рабочими процессами микроскопии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Предоставляет модель на основе zebrafish для изучения консервативных путей развития, применимых к механизмам заболеваний человека.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап фундаментальных открытий с доклиническими исследованиями, позволяя наблюдать за нормальным органогенезом, что способствует валидации биомаркеров in vivo.
- Решения с учетом рисков: Облегчает определение критериев принятия решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), выявляя developmental toxicity или нарушение сигнальных путей с помощью лонгитюдной визуализации.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, обеспечивая итеративные циклы «дизайн-синтез-тестирование-анализ» на ранних этапах исследований.
- Открытийная биология: позволяет проверять гипотезы о функции генов и активности сигнальных путей с помощью неинвазивной таймлапс-визуализации развивающихся эмбрионов с высоким разрешением.
- Скрининг: обеспечивает количественные, пространственно разрешенные фенотипические данные, подходящие для кампаний высококонтентного скрининга, требующих оценки конечных точек развития.
- Аналитика: генерирует временные и морфологические показатели, которые позволяют проводить статистическое сравнение контрольных и опытных групп в различные моменты времени.
- Трансляционные исследования: обеспечивают связь с доклинической валидацией за счет сохранения физиологического развития, что позволяет экстраполировать полученные результаты на модели высших позвоночных.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для монтажа, адаптируемую к различным модальностям микроскопии и модельным системам, что снижает затраты на повторную валидацию в разных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при выборе мишени за счет снижения механистической неопределенности путем прямого наблюдения за фенотипами развития.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость в разных лабораториях благодаря четко определенным этапам подготовки пробирок, нанесения покрытия и заливки.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее выявление проблем развития, что снижает риск отсева на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации соединений с учетом риска на основе лонгитюдного профилирования развития в контексте целого организма.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Danio rerio, стадирования эмбрионов и флуоресцентной микроскопией для обеспечения правильного монтирования и ориентации образца.
- Метод зависит от наличия систем плоскостной световой микроскопии (light sheet microscopy), а также вспомогательного оборудования для очистки трубок, соникации и приготовления растворов.
- Необходима межлабораторная стандартизация концентраций растворов (например, метилцеллюлозы, агарозы, Aros) и протоколов подготовки трубок для обеспечения единообразия получаемых изображений.
- При переносе данного метода на другие мелкие организмы потребуются определенные адаптации, включая корректировку диаметра трубки и вязкости матрицы для иммобилизации.
- Эффективность ограничена требованиями к оптической прозрачности монтажной трубки и необходимостью избегать загрязнения частицами, которые могут ухудшить качество изображения при длительном сборе данных.
