Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы пометить белки на поверхности живых нейронов и впоследствии отличить поверхностный белок от интернализованных белков с помощью дифференциального вторичного мечения антителами. Для этого первичные нейроны, культивируемые на покровном стекле, инкубируются с антителом, направленным против поверхностного эпитопа, и инкубируются для обеспечения интернализации. После инкубации флуоресцентно меченное вторичное антитело наносится для идентификации поверхностно подвергшихся воздействию белков.

Затем применяется избыточное немеченое вторичное антитело для блокирования любых оставшихся комплексов первичных антител поверхностного белка. Затем культивируемые нейроны проникают внутрь и наносят вторичное антитело другого цвета для обнаружения интернализованного белка. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают относительные уровни интернализованного и поверхностного белка с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

После этой процедуры можно получить временной ход интернализации исходного поверхностного белка, дающий информацию о скоростях транспортировки белка в базилике и стимулированных условиях. Начните эту процедуру с подготовки покровных листков для промывки клеточных культур полилизиновым покрытием 18 миллиметрового болического стекла, приготовленных днем ранее, опустив их в три отдельные ополаскивающие чашки, содержащие PBS Добавьте 500 микролитров раствора ламината в лунки 12-луночной пластины, а затем с помощью щипцов поместите покровные листы в каждую. Ну и надавите на каждую крышку, чтобы убедиться, что она находится ровно в основании лунки, инкубируйте в течение двух часов при 37 градусах Цельсия, этот протокол можно выполнить с использованием либо коры мышей E 15, либо крысы бегемота E 18 Campi.

В этой демонстрации используется кора головного мозга мыши. Поместите кору головного мозга из половины помета или одного помета эмбрионов на лед в эйнор объемом в один миллилитр, содержащий PBS с кальцием и магнием, и положите на лед. Далее с помощью микропипетки объемом в один миллилитр удалите PBS из корковой ткани.

Затем добавьте 500 микролитров одного раствора ДНК Паппы в корковую ткань из половины литра эмбрионов. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-20 минут. Дважды в течение инкубационного периода осторожно переворачивайте пробирку, чтобы перемешать содержимое после инкубации, используйте силиконизированную пипетку, отполированную пламенем, чтобы аккуратно переоценить ткань от 10 до 15 раз до получения дисперсии клеток.

Немногие из них, если таковые вообще остаются, позволяют избежать образования пузырьков. Тщательно нанесите диссоциированную клеточную суспензию на трехмиллилитровую подушку 4% BS, A в BSS Хэнка с добавками. Затем в настольной центрифуге с поворотным ротором центрифугу при 100-кратном перегрузке в течение семи минут.

После отжима осторожно удалите надосадочную жидкость, стараясь не аспирировать клеточную гранулу. Затем добавьте один миллилитр полной нейробазальной среды, аккуратно пипетируйте вверх и вниз для ресуспендирования гранулированных клеток. Далее с помощью гемоцитометра определяют концентрацию живых клеток.

Только фазовые яркие элементы следует считать активными непосредственно перед нанесением покрытия. Отсасывайте излишки раствора сыворотки из покрова, проскальзывающего в лунки, и заменяйте его первичной питательной средой для нейронов. Затем добавьте от 75 000 до 100 000 первичных нейронов в каждую лунку.

Культивируйте нейроны в течение 21 дня в нейробазальной среде при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа на седьмой день, а затем каждую неделю добавляйте антимитотический фтор, дезоксиуридин уридин для предотвращения глиального роста и выполняйте половинное среднее изменение. В течение первой недели в культуре у нейронов развились дендритные беседки, как показано на этом изображении двухдневной культуры. Ко второй-третьей неделе они созревают и будут подвергаться синаптогенезу.

Обширная сеть проекций проиллюстрирована на этом рисунке, взятом через 14 дней in vitro для маркировки представляющих интерес белков, подвергшихся воздействию поверхности, добавления первичного антитела непосредственно в кондиционированную среду в соответствующей концентрации. Каждое состояние должно быть протестировано в трех контрольных группах, преиммунной сыворотке или антителах, которые распознают внутриклеточные области белка, не подвергающиеся воздействию во время экзоцитоза, можно использовать в том же разведении, что и исследуемое первичное антитело. Верните клетки в культуральный инкубатор на один, два или четыре часа после инкубации, аспирируйте среду, содержащую антитела, один раз осторожно, но быстро промойте лунки PBS.

Добавьте комнатную температуру, добавив раствор в лунки, затем аспирируя. Затем добавьте свежеприготовленный 4%-ный параформальдегид и выдерживайте в течение пяти минут. Добавьте комнатную температуру для фиксации клеток после фиксации.

Удалите раствор параформальдегида из лунок и выбросьте его в контейнер для жидких отходов в вытяжном шкафу. Затем быстро прополощите клетки трижды PBS, как и раньше. Оставьте третью стирку на месте, чтобы чехол можно было легко снять.

Далее с помощью щипцов аккуратно снимите покровные листки с пластины и поместите их клеточной стороной вверх на лист парама на основании или крышке одноразовой культуральной тарелки. Остальная часть протокола окрашивания будет выполнена на этой поверхности: аккуратно нанесите на клетки блокирующий пипетку раствор PBS 5% BSA, чтобы сделать закругленную каплю в форме пузыря на покровном слипе, чтобы она не высыхала. Выдерживать в течение 30 минут.

Важно помнить, что нельзя добавлять моющее средство в раствор для блокировки. На этой стадии клетки не должны проникать, так как мечению подлежат только белки клеточной поверхности. После блокировки аспирируйте блокирующий раствор, затем для мечения поверхностно открытых белков нанесите флуоресцентно меченное вторичное антитело, затем инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре после инкубации, аспирируйте вторичное антитело и дважды промывайте защитные стекла PBS в течение пяти минут каждый раз, чтобы блокировать любой белок на поверхности клетки, не связанный меченым вторичным антителом.

Инкубируйте непроницаемые нейроны с высокой концентрацией немеченых вторичных антител в течение ночи. При комнатной температуре. Ночная инкубация имеет решающее значение.

Более короткие инкубационные периоды не будут полностью блокировать какое-либо первичное антитело, которое не полностью связано с меченым вторичным антителом. На следующий день промойте чехлы дважды по пять минут каждый PBS, как и раньше. Затем постфиксируйте клетки 4%-ным параформальдегидом в фосфатном буфере в течение пяти минут при комнатной температуре после удаления фиксатора.

Быстро промойте клетки дважды с помощью PBS. Затем для внутриклеточного мечения пермировать и блокировать клетки PBS, содержащим 5% BSA и 0,1% Triton X 100 при комнатной температуре на 30 минут. После проникновения удалите блокирующий раствор.

Следим за тем, чтобы чехол не пересыхал. Добавьте вторичное антитело с другой меткой и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре. После удаления второго вторичного антитела промойте покровные стекла трижды в течение пяти минут PBS.

Затем кратковременно промойте их деионизированной водой монтировкой. Крышка надевается на стеклянные предметные стекла с помощью водной монтажной среды, содержащей средство против выцветания, и позволяет им высохнуть, хранить предметные стекла в темноте при температуре четыре градуса Цельсия для оптимального сохранения флуоресцентного сигнала. Визуализируйте иммуноокрашивающие клетки на конфокальный микроскоп с использованием соответствующих возбуждающих и эмиссионных фильтров.

Используйте одни и те же параметры получения изображений для всех репликаций и условий после создания изображений. Используйте стандартное программное обеспечение для анализа изображений, такое как Fiji Image J или metamorph, чтобы определить интегрированную плотность стандартных областей интереса или атрибуты Пунта, такие как количество и размер, чтобы определить, присутствовал ли ген 6 или говорит шесть, связанный с припадком, на поверхности нейронов и был ли он интернализован с нее. Двухцветное мечение нейронов гиппокампа у культивируемых крыс проводилось в соответствии с описанием в этом видео.

На этом изображении меченый белок клеточной поверхности показан голубым цветом, а интернализованный белок — зеленым. Двойное окрашивание, указанное наконечником стрелки, наблюдалось только в клетке, которая казалась нездоровой, чтобы определить, был ли белок, интернализованный во время инкубации антител, локализованный в эндосомах, нейроны, экспрессирующие маркер ранней переработки эндосомный маркер трансферрин mCherry, иммуноокрашены после проникновения, как показано в этой области дендритного арбора, наблюдалось обширное перекрытие точечного окрашивания с трансферрином, подтверждающим, что интернализованный белок локализовался в эндосомах. Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что одно антитело может быть использовано для различения клеточной поверхности и интернализованных белковых пулов.