Быстрое Синтез и скрининг Химически активированных факторов транскрипции с GFP основе Репортеры

Общая цель этой процедуры заключается в создании, тестировании и валидации генетически кодируемых, индуцируемых искусственных транскрипционных факторов или ATF с желаемой специфичностью. Это достигается путем создания A TF с помощью простого преобразования дрожжей, при котором включение продукта ПЦР с ДНК-связывающим доменом A приводит к слиянию в кадре с рецептором эстрогена человека и VP 16. Вторым этапом процедуры является создание репортерной плазмиды GFP для A TF путем замены сайтов связывания в плазмиде PMN eight на последовательности нацеливания TF.

Третьим этапом процедуры является анализ способности ATF активировать репортер GFP, а также оценка его влияния на физиологию дрожжей путем измерения скорости роста. Заключительным этапом процедуры является использование валидированного ТФ для условной экспрессии нативной геномной мишени. В конечном счете, любой ген-мишень, представляющий интерес, может быть сделан условно активным.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как галактозно-опосредованная индукция экспрессии генов, заключается в том, что селективная индукция может быть достигнута при различных питательных и физиологических условиях без плеотропных эффектов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии дрожжей за счет быстрого и обратимого введения желаемых продуктов генов, что позволяет изучать как приобретение, так и потерю функций. Для начала с помощью ПЦР амплифицируют интересующий ДНК-связывающий домен или DVD с использованием полимеразы высокой точности.

Преобразуйте более одного микрограмма очищенного продукта ПЦР в дрожжи методом ацетата лития. После трансформации вращайте клетки с максимальной скоростью в течение 15 секунд в микроцентрифуге, удалите трансформационную смесь и повторно суспендируйте клетки примерно в 200 микролитрах стерильной воды, прежде чем наносить дрожжевой экстракт. Пептодекстроза или среда YPD на следующий день реплика пластины с YPD на пять пластин с фторэротической кислотой.

После роста в течение двух-четырех дней верните по крайней мере пять-10 колоний на YPD. Затем проведите ПЦР с колониями с использованием праймеров в текстовом протоколе и последовательности для проверки включения. Разбавьте желаемую область связывания олигопластами до эквимолярных концентраций.

Фосфорилировать область связывания с помощью полинуклеотидкиназы Т-4, а затем неотермоциклера в соответствии с условиями реакции в текстовом протоколе. Затем переварите примерно один-два микрограмма ПМН восемь без одного HF и xb. Один на один час при 37 градусах Цельсия в геле.

Очистите полосу позвоночника и разбавьте очищенную основу до 10 нанограмм на микролитр. Затем разбавьте двухцепочечный фосфорилированный сайт связывания до пятикратной молярной концентрации позвоночника на микролитр. С помощью Т-четырех ДНК-лигазы лигируют сайты связывания в расщепленный остов при комнатной температуре в течение 30 минут.

Проведите трансформацию, добавив половину реакции лигирования к 50 микролитрам стандартных химически компетентных клеток кишечной палочки EIA и следуя процедуре, указанной в текстовом протоколе. После восстановления клеток добавьте от 100 до 200 микролитров клеток на лурию берти или фунт плюс ампициллиновую пластину, инкубируйте в течение ночи. На следующий день вырастите кишечную палочку и lb плюс жидкость с ампициллином и соберите плазмидную ДНК, как описано в текстовом протоколе.

Затем последовательность верификации новой репортерной плазмиды из колоний лигирования. Наконец, преобразовать новую репортерную плазмиду в штамм A TF, содержащий E, используя преобразование ацетата лития. Для начала выращивают TF плюс репортер, содержащий штамм на ночь в пяти миллилитрах синтетической полной среды, лишенной урацила.

Возьмите 9 250 миллилитров, встряхните колбу и добавьте в каждую по 25 миллилитров SC за вычетом URA. Затем приготовьте семь колб с различным разведением бета-эстрадиола, как указано в текстовом протоколе, от десятикратного серийного разведения 25 миллимолярного запаса бета-эстрадиола в 125 микролитрах ночных культур до этих семи колб, чтобы две оставшиеся колбы инокулировали конститутивным штаммом, продуцирующим GFP, и штаммом, не имеющим GFP. Они нужны для калибровки проточного цитометра.

Встряхивайте колбу при 200 об/мин и 30 градусах Цельсия в течение 12–18 часов. Затем удалите по 500 микролитров каждой культуры и раскрутите в отдельных пробирках эйнора объемом 1,7 миллилитров. После аспирации надосадочной жидкости однократно промойте гранулированные клетки буфером для проточной цитометрии, затем повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре того же буфера.

Далее добавьте один миллилитр буфера проточной цитометрии к девяти соколам двум. Добавьте ресуспендированные клетки в буфер, содержащий соколиные пробирки, чтобы окончательный объем был равен двум миллилитрам. Наконец, проведите проточную цитометрию.

Используйте прямое рассеивание и боковое рассеивание для идентификации дрожжевых клеток. Установите скорость потока примерно на 3000 ячеек в секунду. Измерьте GFP по 50 каналу и действуйте, как в текстовом протоколе, из замороженных запасов выделите как штамм, содержащий A TF, так и штамм, не содержащий A TF, на YPD После двух дней роста инокулируйте отдельные пробирки с культурой, содержащие пять миллилитров жидкости YPD, и выращивайте каждый штамм в течение ночи при температуре 30 градусов Цельсия.

Выполняют десятикратные серийные разведения 0,25 миллимолярного бета-эстрадиола стокового раствора до 10 000, в 100% этанол. Добавьте по 40 микролитров каждой ночной культуры в 10 миллилитров жидкости YPD. Для каждого штамма добавьте 96 микролитров разведенных клеток в 18 лунок 96-луночного планшета.

Затем добавьте в клетки четыре микролитра бета-эстрадиола. Важным моментом является то, что каждая лунка имеет одинаковое общее количество этанола. Выполните тройной расчет с тремя лунками для каждого штамма, содержащим только этанол.

Органы управления покрывают 96-луночную пластину газопроницаемой мембраной. Отслеживайте рост при оптической плотности 600 нанометров в считывателе пластин. Количественно оценивайте темпы роста с помощью любого количества методов, таких как нахождение максимального наклона.

После подготовки плазмиды в соответствии с инструкциями в текстовом протоколе ПЦР, амплифицируйте в банке MX промоторную кассету. Преобразуйте продукт ПЦР в штамм, экспрессирующий A TF, используя планшет для метода ацетата лития, трансформируйте клетки в YPD и реплику планшета в YPD плюс G 4 18 антибиотика на следующий день. Наконец, подтвердите надлежащую вставку промотора с помощью прямого праймера и обратного праймера, внутренних по отношению к гену, промотор которого был заменен.

Конечный продукт ПЦР составляет приблизительно 1,2 КБ, показанный здесь, представляет собой индукцию GFP тремя различными парами промоторов A TF: Z, четырьмя EVZ, тремя EV, или GEV с течением времени в ответ на один микромолярный бета-эстрадиол. Обратите внимание на увеличение продукции GFP в ответ на ATF, содержащие домены, не связывающие ДНК дрожжей. Это может быть результатом того, что эти факторы достигают специфичности одного гена в геноме дрожжей.

Индукция GEV сама по себе приводит к активации или подавлению сотен генов, в то время как Z 3 EV и Z 4 EV активируют экспрессию только гена-мишени, расположенного ниже синтетического промотора, содержащего соответствующие сайты связывания. Здесь показана индукция GFP Z тремя EV в ответ на нулевой наномолярный бета-эстрадиол и один микромолярный бета-эстрадиол после 18 часов индукции. Флуоресценция также была измерена в клетках, лишенных GFP, чтобы проиллюстрировать жесткую регуляцию системы Z 3 EV. Здесь показана способность Z 3 EV индуцировать GFP в диапазоне концентраций бета-эстрадиола.

Средняя флуоресценция распределений показывает, что связь между концентрацией индуктора и выходом экспрессии оценивается с коэффициентом холма, равным примерно единице, что указывает на независимое связывание Z трех EV После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как микрочипы экспрессии генов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как изменение экспрессии одного гена влияет на геном. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разрабатывать, тестировать и проверять эффективность искусственных транскрипционных факторов. Эти искусственные факторы транскрипции условно контролируют экспрессию генов, расположенных ниже по потоку от соответствующих последовательностей ДНК-мишеней.