Быстрое Синтез и скрининг Химически активированных факторов транскрипции с GFP основе Репортеры

Общая цель данной процедуры заключается в создании, тестировании и валидации генетически закодированных индуцибельных искусственных факторов транскрипции (ИФТ) с заданной специфичностью. Это достигается путем первоначального создания ИФТ посредством простой трансформации дрожжей, при которой включение ПЦР-продукта ДНК-связывающего домена приводит к образованию слияния в одной рамке считывания с человеческим рецептором эстрогена и VP16. Вторым этапом процедуры является создание плазмиды-репортера GFP для ИФТ путем замены сайтов связывания в плазмиде PMN8 на последовательности, таргетируемые ИФТ.

Третьим этапом процедуры является анализ способности ATF активировать GFP-репортер, а также оценка его влияния на физиологию дрожжей путем измерения скорости роста. Заключительный этап процедуры заключается в использовании валидированного ATF для кондиционной экспрессии нативной геномной мишени. В конечном итоге любой интересующий ген-мишень может быть сделан кондиционно активным.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как галактозо-опосредованная индукция экспрессии генов, является возможность достижения селективной индукции при различных питательных и физиологических условиях без плеотропных эффектов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы биологии дрожжей за счет быстрого и обратимого введения необходимых генных продуктов, что дает возможность изучать как усиление, так и потерю функции. Для начала амплифицируйте с помощью ПЦР интересующий ДНК-связывающий домен (DVD), используя высокоточную полимеразу.

Трансформируйте более 1 µg очищенного ПЦР-продукта в дрожжи с помощью метода с использованием ацетата лития. После трансформации центрифугируйте клетки на максимальной скорости в течение 15 секунд в микроцентрифуге, удалите смесь для трансформации и ресуспендируйте клетки примерно в 200 µL стерильной воды перед высевом на среду с дрожжевым экстрактом, пептоном и декстрозой или среду YPD. На следующий день проведите репликационный перенос с YPD на чашки с 5-фтор-оротовой кислотой.

После выращивания в течение двух-четырех дней перенесите не менее пяти-десяти колоний на YPD. Затем проведите колониальную ПЦР, используя праймеры, указанные в текстовом протоколе, и выполните секвенирование для подтверждения вставки. Разведите олигонуклеотиды желаемого связывающего региона до эквимолярных концентраций.

Проведите фосфорилирование области связывания с помощью T4 полинуклеотидкиназы, затем используйте термоциклер Neo в соответствии с условиями реакции, указанными в текстовом протоколе. Далее переварите примерно 1–2 µg PMN 8 с помощью NotI HF и XbaI в течение одного часа при 37 °C.

Очистите полосу с остовом и разведите очищенный остов до концентрации 10 нанограмм на микролитр. Затем разведите двухцепочечный фосфорилированный сайт связывания до молярной концентрации, в пять раз превышающей концентрацию остова на микролитр. С помощью T4 ДНК-лигазы лигируйте сайты связывания в перерезанный остов при комнатной температуре в течение 30 минут.

Выполните трансформацию, добавив половину реакционной смеси лигирования к 50 µL стандартных химически компетентных клеток E. coli штамма EIA, следуя процедуре, описанной в текстовом протоколе. После восстановления клеток нанесите от 100 до 200 µL клеточной суспензии на чашку с агаром LB (или Luria-Bertani) с добавлением ампициллина и инкубируйте в течение ночи. На следующий день культивируйте E. coli в жидкой среде LB с ампициллином и выделите плазмидную ДНК согласно текстовому протоколу.

Затем проведите секвенирование для проверки новой репортерной плазмиды, выделенной из колоний после лигирования. В завершение трансформируйте новую репортерную плазмиду в штамм E, содержащий TF, с помощью метода трансформации ацетатом лития. Для начала вырастите штамм, содержащий TF и репортер, в течение ночи в пяти миллилитрах синтетической полноценной среды без урацила.

Возьмите 9 колб объемом 250 мл и добавьте в каждую по 25 мл среды SC минус URA. Затем подготовьте семь колб с различными разведениями бета-эстрадиола, как указано в текстовом протоколе, используя десятикратное серийное разведение 25 мM стокового раствора бета-эстрадиола; в эти семь колб внесите по 125 мкл ночных культур. В две оставшиеся колбы внесите штамм с конститутивной экспрессией GFP и штамм, не экспрессирующий GFP. Они необходимы для калибровки проточного цитометра.

Инкубируйте колбу при перемешивании со скоростью 200 RPM и температуре 30 °C в течение 12–18 часов. Затем отберите по 500 µL каждой культуры и центрифугируйте в отдельных микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл. После аспирации супернатанта один раз промойте осажденные клетки буфером для проточной цитометрии, затем ресуспендируйте клетки в одном миллилитре того же буфера.

Затем добавьте один миллилитр буфера для проточной цитометрии в девять пробирок Falcon. Перенесите ресуспендированные клетки в пробирки Falcon с буфером до достижения конечного объема 2 мл. В завершение проведите проточную цитометрию.

Используйте прямой и боковой скаттер для идентификации дрожжевых клеток. Установите скорость потока примерно на 3000 клеток в секунду. Измерьте GFP по 50-му каналу и далее действуйте согласно текстовому протоколу: из замороженных стоков высейте штрихом штамм, содержащий A TF, и штамм, лишенный A TF, на среду YPD. После двух дней роста инокулируйте отдельные культуральные пробирки, содержащие пять миллилитров жидкой среды YPD, и культивируйте каждый штамм в течение ночи при 30 °C.

Выполните десятикратные серийные разведения стокового раствора бета-эстрадиола с концентрацией 0.25 millimolar в 100% ethanol до 10 000-кратного разведения. Добавьте 40 µL каждой ночной культуры в 10 mL жидкой среды YPD. Для каждого штамма внесите по 96 µL разведенных клеток в 18 лунок планшета на 96 лунок.

Затем добавьте к клеткам 4 µL бета-эстрадиола. Важно обеспечить одинаковое общее количество этанола в каждой лунке. Для каждого штамма выполните постановку в трех повторностях, используя три лунки только с этанолом.

Контрольные образцы в 96-луночном планшете закрывают газопроницаемой мембраной. Контролируют рост по оптической плотности при 600 нм с помощью планшетного ридера. Количественно определяют скорость роста любым подходящим методом, например, путем поиска максимального наклона кривой.

После подготовки плазмиды согласно текстовому протоколу ПЦР, амплифицируйте кассету промотора MX. Трансформируйте продукт ПЦР в штамм, экспрессирующий A TF, с использованием метода ацетата лития; высейте трансформированные клетки на YPD, а на следующий день сделайте репликационный перенос на YPD с добавлением антибиотика G 418. В завершение подтвердите правильность вставки промотора, используя прямой праймер и обратный праймер, расположенный внутри гена, промотор которого был заменен.

Конечный продукт ПЦР имеет размер примерно 1,2 KB. Здесь показана индукция GFP тремя различными парами промоторов a TF: Z четыре EV, Z три EV или GEV с течением времени в ответ на 1 µM бета-эстрадиола. Обратите внимание на увеличение продукции GFP в ответ на ATF, содержащие ДНК-связывающие домены недрожжевого происхождения. Это может быть следствием того, что данные факторы обеспечивают специфичность к одному гену в геноме дрожжей.

Индукция только GEV приводит к активации или репрессии сотен генов, в то время как Z three EV и Z four EV активируют экспрессию только целевого гена, расположенного после синтетического промотора, содержащего соответствующие сайты связывания. Здесь показана индукция GFP с помощью Z three EV в ответ на 0 нМ бета-эстрадиола и 1 мкМ бета-эстрадиола после 18 часов индукции. Также измерялась флуоресценция клеток, не содержащих GFP, чтобы продемонстрировать строгую регуляцию системы Z three EV. Здесь показана способность Z three EV индуцировать GFP в диапазоне концентраций бета-эстрадиола.

Средняя флуоресценция распределений показывает, что зависимость между концентрацией индуктора и уровнем экспрессии является постепенной с коэффициентом Хилла приблизительно равным единице, что указывает на независимое связывание Z three EV. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как микрочипы для анализа экспрессии генов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, как изменение экспрессии одного гена влияет на общегеномные паттерны экспрессии генов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как конструировать, тестировать и проверять эффективность искусственных транскрипционных факторов. Эти искусственные транскрипционные факторы условно контролируют экспрессию генов, расположенных ниже соответствующих целевых последовательностей ДНК.