Системная Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников у мышей с хроническим ЕАЕ

Общая цель этого протокола заключается в доставке нейральных стволовых клеток-предшественников в ЦНС путем внутривенной инъекции мышам, страдающим экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом, моделью заболевания, которая имитирует рассеянный склероз. Это достигается путем получения нейронных стволовых клеток-предшественников, или NPC, из субвентрикулярной зоны мозга от взрослых мышей. Второй шаг заключается в генетической маркировке NPC с помощью технологии вирусного вектора для идентификации и отслеживания клеток in vivo.

Затем пролиферирующие нейросферы диссоциируют в одноклеточную суспензию, ресуспендируют при желаемой плотности и вводят в хвостовую вену мышей EAE на пике заболевания. В конечном счете, проводится патологоанатомия органов и тканей и иммуногистохимия для выявления и характеристики выживаемости, распределения и интеграции введенных стволовых клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает минимально инвазивный, безопасный и эффективный метод трансплантации стволовых и прогениторных клеток в воспалительную нервную систему.

Этот метод помогает ответить на три ключевых вопроса, связанных с безопасностью и эффективностью системно вводимых стволовых клеток в моделях воспалительных заболеваний нервной системы. Визуальная демонстрация этого метода особенно полезна для молодых ученых, поскольку она помогает в понимании критических экспериментальных этапов от выделения стволовых клеток мозга до подготовки к системной инъекции в мышиную модель рассеянного склероза. Использование правильной стерильной техники.

Поместите только что изолированный мозг на матрицу для среза мозга. С помощью двух бритвенных лезвий произведите корональные срезы, расположенные в двух миллиметрах от переднего полюса мозга, исключая оптические дорожки и на три миллиметра позади предыдущего разреза. Поместите срезы мозга на чистую чашку Петри и работайте под препарирующим микроскопом, чтобы изолировать ткань субвентрикулярной зоны.

Измельчив ткань, добавьте в нее 30 миллилитров предварительно приготовленного и процеженного раствора для варежки. Аккуратно встряхните и выдержите в течение 30 минут, встряхивая каждые 15 минут. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах полного роста.

Среда или НМГ методом пипетирования. Сначала с помощью пипетки P 1000, а затем с помощью пипетки P 200. Как только будет достигнута одноклеточная суспензия, доведите ее до пяти миллилитров с помощью CGM и переложите в новую колбу.

Поместите клетки в инкубатор и дайте нейросферам сформироваться в течение пяти-семи дней. Когда все будет готово, соберите суспензию в пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте. Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте небо в 200 микролитрах НМГ.

Диссоциируйте нейросферы механическим способом, пропустив их через наконечник пипетки P 200 от 100 до 150 раз. Доведите суспензию до одного миллилитра с помощью CGM. Далее точно разбавляем суспензию.

Смешайте соответствующий объем с жизненно важным красителем и заполните гемоцитометр для определения количества клеток. Суспендируйте клетки в нужной концентрации и переложите в новую колбу. Повторяйте эти шаги каждые четыре-пять дней, чтобы помочь идентификации трансплантированных клеток in vivo.

NPC трансдуцируются вирусными векторами, кодирующими репортерные гены, через 72 часа после трансдукции NPC. Экспрессия флуоресцентных репортерных генов может быть проверена с помощью иммунофлуоресценции или проточной цитометрии. Когда все будет готово, соберите нейросферы, экспрессирующие GFP, путем центрифугирования и удалите надосадочную жидкость.

Далее добавьте 200 микролитров раствора для диссоциации клеточных агрегатов и инкубируйте в течение 10 минут. Извлеките клетки и аккуратно восстановите их, чтобы получить суспензию за одну клетку. Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха.

После подсчета и разбавления клеток держите клеточную суспензию на льду до готовности к использованию. Как только нейросферы будут готовы, возьмите мышей, которые ранее были подготовлены к тому, чтобы служить мышиной моделью для ЦНС. Лечение повреждений должно происходить на пике проявления заболевания.

Начните с помещения мышей в согревающую коробку примерно на 10 минут, чтобы хвостовая вена расширилась. Когда все будет готово, переложите одну мышь из грелки в удерживатель для мышей. Закройте ограничитель, чтобы ограничить движения и изолировать хвост.

Простерилизуйте место инъекции на хвосте соответствующим раствором для местного применения. Наполните инсулиновый шприц объемом один миллилитр 150 микролитрами клеточной суспензии и обязательно удалите все пузырьки. Локализуйте жилку на тыльной поверхности хвоста и расположите иглу параллельно жилке в средней нижней части хвоста.

Здесь вена находится ближе к поверхности кожи. Тем самым облегчая процедуру. Аккуратно введите иглу в вену, убедившись в ее правильном положении, взяв несколько микролитров крови.

Затем медленно введите раствор в хвостовую вену После инъекции извлеките иглу и надавите на несколько секунд, чтобы замедлить кровотечение. Поместите мышь в свежую клетку и следите за ней, пока она не выздоровеет. Повторите ту же процедуру для всех мышей в заранее определенные экспериментальные моменты времени.

Образцы отбирают у обработанных и контрольных животных и анализируют для определения инфильтрации и интеграции NPC в ЦНС и другие ткани при пролиферации в виде нейросфер NPC экспрессируют маркеры митотической активности, такие как фосфо хизон H 3, показанные зеленым цветом, и недифференцированные нервные клетки, такие как гнездо, показаны красным цветом при нанесении покрытия в соответствующих условиях дифференцировки. NPC экспрессируют маркеры, типичные для трех нейронных линий, такие как маркер астроглии, GFAP, нейрональный маркер, микроканальцевый ассоциированный белок 2, а также олиго-дильные глиальные маркеры O 4 и ядра основного белка миелина, противоокрашены DPI. Недифференцированные МПК, которые должны быть терапевтически эффективными после трансплантации, должны экспрессировать молекулы адгезии клеточной поверхности, которые включают CD 44 и альфа-4 субъединицу очень позднего антигена 4. Эти примеры показывают, что трансдуцированные NPC экспрессируют GFP как в виде пролиферирующих нейросфер, так и при дифференцировке in vitro при отмене фактора роста. Сингенные NPC, системно вводимые мышам EAE, обнаруживаются почти исключительно в периваскулярных областях повреждения ЦНС, обозначенных стрелками, как в головном, так и в спинном мозге в течение 45 дней после трансплантации.

Ключевым этапом этой процедуры является диссоциация клеток. На самом деле, приготовление суспензии одиночных клеток имеет основополагающее значение для того, чтобы избежать зажимов или агрегатов, которые могут привести к окклюзии сосуда после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области регенеративной медицины, которые изучали минимально инвазивные протоколы для эффективной доставки непериодических стволовых клеток в мозг небольших лабораторных животных, а в ближайшей перспективе — людей, страдающих воспалительными неврологическими заболеваниями.

После просмотра этого видео, мы надеемся, у вас будет четкое представление об устранении неполадок, связанных с выделением, подготовкой и системным введением тканеспецифических стоек у лабораторных животных с заболеваниями головного мозга.