Модифицированный Осадки Метод изолировать мочевых экзосомы

Общая цель этой процедуры заключается в разработке модифицированного метода осаждения экзосом, который предлагает быструю, масштабируемую и эффективную альтернативу для выделения экзосом из мочи. Это достигается путем удаления крупных мертвых клеток и клеточного мусора из образца мочи с помощью центрифугирования, а сна, содержащая экзосомы мочи, переносится в свежую пробирку. На втором этапе гранулу растворяют в изоляционном растворе, содержащем DTT, для удаления белка лошадиного падения.

Затем, после дальнейшего центрифугирования, невредимую надосадочную жидкость инкубируют с реагентом Exo Quick TC в течение ночи для осаждения экзосом на следующий день. Обработанные реагентом ТС образцы exo quick центрифугируются в последний раз для получения экзосомной гранулы. В конечном счете, последующие процессы, такие как вестерн-блоттинг и QPCR в реальном времени, могут быть выполнены на экзосомах для определения биомаркеров, представляющих интерес.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ультрацентрификация, фильтрация и осаждение, заключается в том, что армовый метод не требует этапов ультрасертификации, легко выполняется относительно быстро, при этом обеспечивая высокий, относительно чистый выход экзосом для последующего молекулярного анализа перед сбором мочи. По 3,125 мл свежеприготовленного коктейля ингибитора протеазы выньте в пустой стерильный сосуд, а затем соберите примерно 10 миллилитров первой мочеиспускания в сосуд. Переложите образец в конические пробирки объемом 15 миллилитров.

Обратите внимание, что собранный за 24 часа образец мочи также можно использовать для выделения экзосом, храня его при температуре четыре градуса Цельсия. Вращайте трубки в течение 10 минут при температуре 17 000 GS и 37 градусов Цельсия, чтобы удалить или отделить клеточный мусор от мочевых экзосом. Далее, стараясь не потревожить гранулу, переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах изоляционного раствора.

Инкубируйте гранулу с DTT при конечной концентрации 200 мг на миллилитр при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Вортексирование образца каждые две минуты. Затем, когда гранула полностью растворится, добавьте в образец 500 микролитров изоляционного раствора и сразу же раскрутите полученную суспензию.

Соедините надосадочную жидкость с ранее собранной надосадочной жидкостью и восстановите новую гранулу в 50 микролитрах изоляционного раствора. Для анализа страницы SDS с целью выделения экзосом сначала инкубируйте 11 миллилитров объединенной надосадочной жидкости с 3,3 миллилитрами реагента exo quick TC при четырех градусах Цельсия в течение не менее 12 часов. После инкубации образец центрифугируют, затем переносят надосадочную жидкость в свежую пробирку для анализа страницы SDS, и гранула, содержащая экзосомы мочи, используется для извлечения D-N-A-R-N-A или белка или хранится при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Используйте спектрофотометр NanoDrop для определения концентраций ДНК и РНК при каждой экстракции, измеряя поглощение на глубинах 260 и 280 нанометров с помощью двух микролитров образца. Модифицированное воспроизведение анализа страницы SDS и обнаружение биомаркеров с использованием западного анализа крови показано на дорожках с необработанной мочой, и наблюдались первые баны белка мочевых гранул, соответствующие 90-100 килодальтонам, что указывает на наличие и удаление белка падения лошади TAM соответственно в конечных линиях надосадочной жидкости и экзосомных гранул. Полоса белка падения лошади TAM не наблюдалась, что указывает на удаление белка падения лошади TAM на ранних стадиях и приводит к увеличению выхода гранул экзосом.

В этом эксперименте биомаркеры Alex и TSG 1 0 1 были обнаружены даже при использовании небольших количеств образца, что указывает на очень чистую гранулу экзосомы для анализа биомаркеров и отсутствие большого количества растворимых белков, включая белок падения лошади TAM после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области хронической болезни почек к использованию изолированных экзосом, выделенных из мочи, для раннего выявления и диагностики диабетической нефропатии.