Модифицированный Осадки Метод изолировать мочевых экзосомы
16 января 2015 г.
В этой рукописи описывается протокол выделения экзосом из мочи человека с использованием модифицированной техники осаждения.
Общая цель этой процедуры заключается в разработке модифицированного метода осаждения экзосом, который предлагает быструю, масштабируемую и эффективную альтернативу для выделения экзосом из мочи. Это достигается путем удаления крупных мертвых клеток и клеточного мусора из образца мочи с помощью центрифугирования, а сна, содержащая экзосомы мочи, переносится в свежую пробирку. На втором этапе гранулу растворяют в изоляционном растворе, содержащем DTT, для удаления белка лошадиного падения.
Затем, после дальнейшего центрифугирования, невредимую надосадочную жидкость инкубируют с реагентом Exo Quick TC в течение ночи для осаждения экзосом на следующий день. Обработанные реагентом ТС образцы exo quick центрифугируются в последний раз для получения экзосомной гранулы. В конечном счете, последующие процессы, такие как вестерн-блоттинг и QPCR в реальном времени, могут быть выполнены на экзосомах для определения биомаркеров, представляющих интерес.
Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как ультрацентрификация, фильтрация и осаждение, заключается в том, что армовый метод не требует этапов ультрасертификации, легко выполняется относительно быстро, при этом обеспечивая высокий, относительно чистый выход экзосом для последующего молекулярного анализа перед сбором мочи. По 3,125 мл свежеприготовленного коктейля ингибитора протеазы выньте в пустой стерильный сосуд, а затем соберите примерно 10 миллилитров первой мочеиспускания в сосуд. Переложите образец в конические пробирки объемом 15 миллилитров.
Обратите внимание, что собранный за 24 часа образец мочи также можно использовать для выделения экзосом, храня его при температуре четыре градуса Цельсия. Вращайте трубки в течение 10 минут при температуре 17 000 GS и 37 градусов Цельсия, чтобы удалить или отделить клеточный мусор от мочевых экзосом. Далее, стараясь не потревожить гранулу, переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах изоляционного раствора.
Инкубируйте гранулу с DTT при конечной концентрации 200 мг на миллилитр при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Вортексирование образца каждые две минуты. Затем, когда гранула полностью растворится, добавьте в образец 500 микролитров изоляционного раствора и сразу же раскрутите полученную суспензию.
Соедините надосадочную жидкость с ранее собранной надосадочной жидкостью и восстановите новую гранулу в 50 микролитрах изоляционного раствора. Для анализа страницы SDS с целью выделения экзосом сначала инкубируйте 11 миллилитров объединенной надосадочной жидкости с 3,3 миллилитрами реагента exo quick TC при четырех градусах Цельсия в течение не менее 12 часов. После инкубации образец центрифугируют, затем переносят надосадочную жидкость в свежую пробирку для анализа страницы SDS, и гранула, содержащая экзосомы мочи, используется для извлечения D-N-A-R-N-A или белка или хранится при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Используйте спектрофотометр NanoDrop для определения концентраций ДНК и РНК при каждой экстракции, измеряя поглощение на глубинах 260 и 280 нанометров с помощью двух микролитров образца. Модифицированное воспроизведение анализа страницы SDS и обнаружение биомаркеров с использованием западного анализа крови показано на дорожках с необработанной мочой, и наблюдались первые баны белка мочевых гранул, соответствующие 90-100 килодальтонам, что указывает на наличие и удаление белка падения лошади TAM соответственно в конечных линиях надосадочной жидкости и экзосомных гранул. Полоса белка падения лошади TAM не наблюдалась, что указывает на удаление белка падения лошади TAM на ранних стадиях и приводит к увеличению выхода гранул экзосом.
В этом эксперименте биомаркеры Alex и TSG 1 0 1 были обнаружены даже при использовании небольших количеств образца, что указывает на очень чистую гранулу экзосомы для анализа биомаркеров и отсутствие большого количества растворимых белков, включая белок падения лошади TAM после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области хронической болезни почек к использованию изолированных экзосом, выделенных из мочи, для раннего выявления и диагностики диабетической нефропатии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи описывается протокол выделения экзосом из мочи человека с использованием модифицированного метода осаждения. Данный метод призван обеспечить быстрый, масштабируемый и эффективный альтернативный способ выделения экзосом.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Исследования экзосом
Теоретические основы
- Экзосомы представляют собой малые внеклеточные везикулы, участвующие в межклеточной коммуникации.
- Выделение экзосом из мочи позволяет получить сведения о различных биологических процессах.
- Существующие методы могут быть трудоемкими и менее эффективными.
- Модифицированный метод осаждения может повысить степень извлечения экзосом.
Цель исследования
- Разработать экспресс-метод выделения экзосом из мочи.
- Повысить масштабируемость и эффективность экстракции экзосом.
- Облегчить выполнение последующих этапов анализа, таких как идентификация биомаркеров.
Используемые методы
- Центрифугирование для удаления крупных клеток и клеточного детрита из образцов мочи.
- Растворение осадка в растворе для выделения, содержащем DTT.
- Инкубация супернатанта с реагентом exo quick TC в течение ночи.
- Заключительное центрифугирование для получения осадка экзосом.
Основные результаты
- Модифицированный метод позволяет успешно выделять экзосомы из мочи.
- Экзосомы могут быть использованы для последующего анализа, такого как вестерн-блоттинг и кПЦР.
- Эффективное удаление загрязняющих веществ повышает чистоту выделенных экзосом.
- Протокол масштабируем для работы с бóльшими объемами образцов.
Выводы
- Модифицированная техника осаждения является жизнеспособным методом выделения экзосом.
- Данный подход может оптимизировать исследования экзосом в различных биологических работах.
- В будущих исследованиях могут быть изучены дополнительные области применения выделенных экзосом.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Выделение экзосом мочи позволяет неинвазивно обнаруживать биомаркеры заболеваний почек, что способствует ранней диагностике и снижению рисков при изучении механизмов разработки препаратов для терапии почечной недостаточности. Модифицированный метод осаждения представляет собой масштабируемую и высокопродуктивную альтернативу ультрацентрифугированию, повышая воспроизводимость и пропускную способность рабочих процессов валидации мишеней. Данный подход повышает достоверность прогнозирования при идентификации биомаркеров за счет снижения уровня загрязнения и повышения чистоты экзосом для последующего молекулярного профилирования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения экзосом, которые отражают специфичный для данного типа клеток набор молекул из сегментов нефрона.
- Практическая ценность: Обеспечивает быстрый, масштабируемый метод выделения экзосом без применения ультрацентрифугирования, что снижает техническую вариабельность.
- Прогностическая ценность: Повышает достоверность обнаружения биомаркеров, позволяя получать высокочистые осадки экзосом, обогащенные miRNA и mRNA для профилирования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных образцов экзосом для последующих анализов, таких как вестерн-блоттинг и qPCR, с целью обнаружения биомаркеров, связанных с заболеванием.
- Практическая ценность: Стандартизация изоляции экзосом с помощью метода осаждения, совместимого с высокопроизводительной обработкой образцов.
- Готовность к анализу: Обеспечение стабильного выхода экзосом, пригодных для экстракции РНК и белкового анализа, что способствует воспроизводимому скринингу биомаркеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает переход от поиска биомаркеров в моче к доклинической валидации, предоставляя релевантный заболеванию состав экзосом.
- Снижение механистических рисков: позволяет выявлять изменения в содержимом экзосом при почечной дисфункции, что проясняет патофизиологические пути.
- Прогностическая достоверность: облегчает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, связывая биомаркеры экзосом с ранними признаками диабетической нефропатии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса поиска — от проверки гипотез до идентификации ведущих соединений, обеспечивая неинвазивную изоляцию биомаркеров, что способствует обоснованному выбору мишени и преемственности на доклиническом этапе.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез путем выделения экзосом, содержащих специфический груз клеток мочевыводящих путей в зависимости от их происхождения.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимый количественный выход экзосом, подходящий для разработки методов анализа биомаркеров и скрининга соединений.
- Аналитика: позволяет измерять уровни ассоциированных с экзосомами РНК и белков с помощью qPCR и вестерн-блоттинга для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывает биомаркеры экзосом мочи с доклиническими моделями заболеваний почек посредством обнаружения специфического для болезни груза.
- Корпоративное использование: создает масштабируемую стандартизированную платформу для выделения, применимую для различных типов образцов мочи и исследовательских программ.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Улучшает валидацию мишеней за счет снижения механистической неопределенности путем выделения чистых экзосом для профилирования биомаркеров.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию и масштабируемость за счет исключения этапов ультрацентрифугирования и упрощения рабочего процесса.
- Стратегическая ценность: Способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет повышения достоверности раннего обнаружения биомаркеров заболеваний почек.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов на терапию почек с учетом рисков на основе надежных данных о биомаркерах экзосом.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области биологии экзосом и владение методами молекулярной биологии, такими как экстракция РНК и кПЦР.
- Необходим доступ к центрифугам, реагенту ExoQuick TC и спектрофотометрическому оборудованию для количественного определения РНК/ДНК.
- Необходима стандартизация работы между группами исследователей для обеспечения единообразного времени инкубации, температурного режима и правил обращения с реагентами.
- При применении метода к различным протоколам сбора мочи или условиям хранения следует учитывать необходимость адаптации процедуры.
- Практические ограничения включают необходимость инкубации в течение ночи и осторожное обращение с образцами во избежание потери экзосом при переносе.
