Анализ инициации трансляции во время стресса кондиций полисом профилирования

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить влияние стрессовых состояний на трансляцию, инициацию клеток и тканей млекопитающих с помощью полисомного профилирования. Это достигается путем первичной обработки раковых клеток млекопитающих противораковым препаратом, а затем получения клеточных экстрактов. Второй шаг – сделать сахарозу, градиенты.

Затем клеточные экстракты загружают на сахарозу, градиенты и ультрацентрифугируют для разделения рибосомных фракций. В конечном счете, проводится вестерн-блоттинг с использованием специфических антител для оценки ассоциации тестируемых белков с полисомами. Основное преимущество данной методики из такого существующего метода, как метаболическое мечение, заключается в том, что она позволяет оценить влияние стрессовых состояний на начальный этап трансляции.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области стресс-терапии, такие как влияют ли противораковые препараты на инициацию трансляции и если да, то как. Применение этой техники распространяется и на терапию рака, поскольку она помогает выявить новые регуляторные пути инициации трансляции. Хотя этот метод может дать представление о регуляции инициации трансляции в клеточных культурах, он также может быть применен к другим системам, таким как изолированные ткани, включая мозг и опухоли.

Чтобы подготовить автоматизированную систему фракционирования градиента плотности, сначала промойте систему трубок аппарата 0,1% SDS в течение пяти минут. Затем промойте систему трубок 70% этанолом в течение пяти минут, а затем раствором RNA Zap в течение пяти минут. И, наконец, с помощью DEPC, воды, высушите систему трубок, нагнетая воздух в систему.

Затем приготовьте 15% и 55% растворы сахарозы для получения линейного градиента от 15 до 55% сахарозы с помощью формовщика первого 60 градиента модели ISCO. Следуя инструкциям производителя, важно тщательно контролировать скорость трис-перистальтического насоса, чтобы избежать образования пузырьков или турбулентностей в градиентах в то время, когда программа градиента работает над охлаждением ультрацентрифуги до четырех градусов Цельсия. Сохраняйте градиент на уровне четырех градусов Цельсия до тех пор, пока в этом эксперименте не будут использованы клетки рака шейки матки с низким проходимостью, предварительно покрытые для достижения 80% конфлюенции.

В день проведения эксперимента. Важно проводить экстракцию из свежих клеток и во избежание контаминации РНК во время этой процедуры, за 90 минут до добавления противоракового препарата замените среду клеток свежей, полноценной средой. Чтобы стимулировать трансляцию, верните клетки в инкубатор.

Добавьте противораковый препарат непосредственно в клеточную культуру в качестве контрольной добавки. ДМСО инкубируйте в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа через четыре часа, поместите планшеты на лед и трижды промойте клетки холодным PBS в одном миллилитре буфера для лизиса для достижения наилучших результатов. Используйте примерно 12 миллионов клеток для каждого экспериментального условия.

Переложите клетки из скребковых пластин в эйнорскую трубку и хорошо перемешайте, пропустив их 15 раз через шприц. Дайте клеточным лизатам отдохнуть на льду в течение 15 минут. Затем нанесите несколько капель клеточного лизата на предметное стекло и оцените клеточный лизис с помощью фазово-контрастной микроскопии с использованием объектива 10-кратного увеличения.

После того, как лизис клеток будет проверен, осветите лизат клеток центрифугированием при 11 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите растворимый лизат, содержащий полирибосомы, в новую пробирку и держите его на льду перед загрузкой цитоплазматических экстрактов на градиенты сахарозы. Осторожно измерьте концентрацию присутствующей РНК с помощью спектрофотометра и медленно загрузите примерно 20 OD две 60 единиц экстракта на градиент сахарозы от 15 до 55%.

Убедитесь, что на поверхности пробирки имеется два-три миллиметра свободного пространства, чтобы избежать переполнения пробирки во время центрифугирования. Загрузите трубки на ротор. Поместите ротор на ультрацентрифугу и центрифугируйте градиент при 230 000 G при четырех градусах Цельсия в течение двух часов и 30 минут.

Когда центрифугирование будет завершено, извлеките пробирки и осторожно положите их на лед, не нарушая градиенты. Чтобы начать фракционирование цитоплазматических экстрактов, поместите градиенты сахарозы в автоматизированную систему фракционирования плотности и приступайте к автоматическому фракционированию и сбору фракций, как описано производителем. Соберите каждую фракцию объемом 0,5 миллилитра в отдельные пробирки Эйнора с непрерывным мониторингом поглощения на 250 нанометрах параллельно с операцией градиентного фракционирования, полирибосомный профиль будет редактироваться на бумаге диаграммы в конце каждого прогона.

Переложите концевые трубки с собранными фракциями на лед. Чтобы начать эту процедуру, добавьте два объема 100% холодного этанола в каждую собранную фракцию и дайте белковым комплексам РНК выпасть в осадок при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи. Для экстракции белков центрифугируйте каждый белок РНК в осадке при 11 000 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия после промывки 70%-ным этанолом на воздухе, высушите и повторно суспендируйте осадок.

Образец буфера для страницы SDS Прежде чем приступить к анализу вестерн-блоттинга для экстракции РНК Resus, суспендируйте каждый преципитат белка РНК в буфере для лизиса, содержащем 0,1% SDS, расщепите белковый компонент осадка с двумя миллиграммами на миллилитр протеиназы K в течение 30 минут. В водяную баню с температурой 55% Цельсия добавьте один объем фенолхлороформа, два объема хлороформа и 0,1 объема двух моляров ацетата натрия pH четыре. Дайте ему отдохнуть на льду в течение 15 минут.

Центрифугируйте при 10 000 GS при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Соберите полученную водную фазу каждого образца осажденной РНК, добавив один объем изопропанола и 0,2 мкг на микролитр гликогена и оставив его при температуре минус 20 градусов Цельсия на ночь. На следующий день вращайте осадок при давлении 10 000 G при четырех градусах Цельсия в течение одного часа.

Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулу РНК 70%-ным холодным этанолом, ресуспендируйте гранулу РНК в небольшой объем РНК. Бесплатная вода. Оцените количество и качество РНК с помощью спектрофотометра.

Здесь представлены репрезентативные профили полисом из цитоплазматических экстрактов. Получен из хелоклеток, выращенных либо в нормальных условиях, либо после обработки ингибитором протеасом в течение четырех часов, и центрифугирования с линейным градиентом сахарозы от 15 до 55% объема к весу. В каждом профиле указаны положения рибосом 40 с 60 с, рибосом 80 с, монос и полисомы.

Фракции слева направо были собраны и проанализированы методом вестерн-блоттинга с антителами к крупному рибосомному белку L 28, а также полисомному ассоциированному белку FMRP, которые служат контролем целостности полисом в нормальных условиях роста. Комплексы инициации трансляции превращаются в полирибосомы, обнаружение которых с помощью полисомного профилирования является проверкой активной инициации трансляции, как это наблюдается здесь. Лечение ингибитором протеасом уменьшает пики полисом с сопутствующим увеличением DS Monos, что указывает на ингибирование инициации трансляции При посещении этой процедуры важно работать в среде, свободной от рназы, чтобы осторожно обрабатывать градиенты и контролировать лизис клеток После этой процедуры.

Другие методы, такие как западная кровь и северная кровь, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, с ассоциацией специфического белка или М-МНК с полисомой, на которую влияет противораковое лечение после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области перевода к изучению влияния регулирующих факторов инициации трансляции на такие заболевания человека, как рак и нейродегенеративные заболевания.