Снижение Итраконазол Концентрация и продолжительность успешны в лечении

Общая цель данной процедуры заключается в лечении амфибий, инфицированных грибком, вызывающим хитридиомикоз амфибий, *Batrachochytrium dendrobatidis* (BD), с использованием противогрибкового химиотерапевтического препарата итраконазола. Это достигается путем предварительного выращивания культур BD и инокуляции животных грибковым патогеном. На втором этапе проводится тестирование животных с помощью экстракции ДНК и количественной ПЦР (qPCR) мазков с кожи для подтверждения инфекции BD.

Затем инфицированных животных подвергают лечению путем купания в 0,0025% растворе эконазола по пять минут в день в течение шести дней. Заключительный этап заключается в мониторинге статуса инфекции у пролеченных животных путем проведения QPCR-анализа мазков с кожи в течение минимум четырех недель после завершения курса терапии для подтверждения успешного излечения животного; данная процедура демонстрирует, что сниженная концентрация и сокращенное время применения противогрибкового средства итраконазола эффективны для лечения животных, инфицированных bd. Основным преимуществом использования данной схемы лечения по сравнению с рекомендованной дозой, которая составляет 0,01% раствор итраконазола в течение 11 дней, является то, что снижение концентрации до одной четверти от рекомендованной дозы и сокращение времени лечения до шести дней остаются эффективными для излечения от инфекции BD, а также сводят к минимуму негативные побочные эффекты, возникающие при использовании рекомендованной дозы препарата.

После инкубации BD в бульоне с тритоном, как описано в текстовом протоколе, и проверки подвижности спор Zo, залейте каждую чашку пятью миллилитрами отстоянной водопроводной воды и подождите 10 минут, чтобы споры ZO проникли в среду. Затем перелейте суспензию спор Zo в портативный контейнер. Определите концентрацию спор ZO с помощью гемоцитометра и разведите смесь отстоянной водопроводной водой до концентрации 1 × 10⁶ на 3 мл для инокуляции животного, такого как Latoria vei Alpina, показанного здесь.

Удерживая животное над контейнером объемом 50 мл, вылейте три миллилитра смеси инокулята на его брюшко. Затем поместите животное в контейнер с остатками инокулята. Закройте контейнер крышкой и оставьте животное в нем на 24 часа для обеспечения инфицирования.

Чтобы предотвратить контаминацию патогеном BD, снимите старые перчатки и поместите их в автоклав перед утилизацией. После надевания новой пары перчаток приступайте к инокуляции следующего животного.

Через 24 часа после инокуляции верните животных в их индивидуальные продезинфицированные террариумы на две недели. Не забудьте продезинфицировать все жидкие отходы перед утилизацией, доведя концентрацию раствора отбеливателя до 10% через две недели. Проверьте успешность инфицирования BD, взяв мазок с животных стерильным ватным тампоном.

Осторожно вращайте тампон во время и между движениями. Проведите тампоном по пять раз по брюшной стороне с каждой стороны, по каждому бедру и по каждой из четырех конечностей, всего 45 движений. Храните тампоны в микропробирках объемом 1.5 milliliter при температуре minus 20 degrees Celsius.

Выделите геномную ДНК из мазков, используя имеющийся в продаже набор для изоляции ДНК, и проведите QPCR согласно текстовому протоколу. Подготовьте три лечебные ванны, по одной для каждой из трех дозировок итраконазола, как описано в текстовом протоколе. Затем поместите отдельных амфибий в дезинфицированные.

Контейнеры объемом 50 миллилитров с 35 миллилитрами раствора для обработки. Не забывая менять перчатки между животными, периодически осторожно встряхивайте контейнер круговыми движениями, чтобы животные были полностью покрыты раствором в течение пяти минут. По истечении пяти минут верните животных в дезинфицированную зону.

Повторяйте пятиминутную процедуру ежедневно в течение следующих пяти дней. Снова проверьте животных на наличие инфекции BD через одну неделю после завершения лечения, а затем раз в неделю в течение четырех недель, чтобы убедиться, что инфекция была полностью устранена. Обратите внимание, что даже после завершения лечения с животными следует обращаться так, будто они все еще представляют риск контаминации.

Животных необходимо содержать в отдельной зоне в течение как минимум одного месяца после заражения. Если лечение не принесло результатов, его следует повторить. Разные виды и разные стадии жизненного цикла по-разному реагируют на инфекцию и режимы лечения, поэтому перед широким внедрением метода лечения необходимо провести его апробацию.

Поскольку BD представляет собой биологическую опасность, еженедельно дезинфицируйте каждый террариум, погружая террариум и емкости для обработки в 10% раствор отбеливателя. Выдерживайте в растворе не менее 30 секунд, затем промойте отбеливатель водой дважды и дайте контейнерам высохнуть в течение 24 часов перед повторным использованием для выживания лягушек. Здесь показаны результаты после 11 дней или шести дней обработки от BD.

Черные стрелки указывают на последний день лечения. Сплошные линии отражают выживаемость контрольных групп. Сплошные черные линии относятся к животным, у которых был положительный результат на BD, но которые не получали лечения против BD.

Сплошные серые линии соответствуют животным, которые были отрицательными по BD и не получали лечения BD. Пунктирные линии показывают выживаемость групп лечения, получавших эконазол в указанной концентрации. Все животные, получавшие 0.0025% в ингаляторе в течение шести дней, были отрицательными по BD через четыре недели после окончания лечения, и таким образом данное лечение было признано успешным.

Кроме того, при данной дозировке эконазола смертность существенно не отличалась от показателей в группе положительного контроля BD. Следует отметить, что применение эконазола в концентрациях 0,01% и 0,005% в течение 11 дней привело к значительному увеличению смертности по сравнению с положительным контролем BD. Не забывайте, что грибковый патоген BD представляет собой биологическую опасность, что требует соблюдения мер предосторожности, таких как использование и смена перчаток, автоклавирование всех твердых отходов и проведение дезинфекции.

При выполнении данной процедуры необходимо обеспечить надлежащую утилизацию всех жидких отходов.