Сортировка

Общая цель данной процедуры заключается в сортировке мицелиальных гранул, образованных нитчатыми streptomyces, по размеру с помощью проточного цитометра COPA для крупных частиц. Это достигается сначала путем выращивания и последующего отбора проб желаемого бактериального штамма. На втором этапе проводится измерение образца штамма с помощью COPA.

Затем данные анализируются in silico, а мицелиальные пеллеты сортируются в соответствии с параметрами, определенными пользователем. В конечном итоге эти анализы могут быть использованы для дальнейшей характеристики гетерогенности размеров пеллет. Хотя данный метод может быть использован для streptomyces, его также можно применить к другим организмам, таким как нитчатые грибы; эту процедуру продемонстрирует MaRous Petrus, аспирант нашей лаборатории.

Сначала подготовьте культуры, добавив 100 миллилитров среды на дрожжевом и солодовом экстрактах и 0,2 миллилитра 2,5 молярного раствора хлорида магния в одну стерильную колбу Эрленмейера объемом 250 миллилитров, оснащенную металлическими спиральными пружинами, для каждого образца бактерий. Затем инокулируйте каждую колбу количеством 1 × 10⁸ спор streptomyces, чтобы получить концентрацию спор 1 × 10⁶ спор на миллилитр, и культивируйте бактерии при 30 °C с перемешиванием при 180 RPM. Через два дня с помощью стерильной пипетки объемом пять миллилитров отберите пробу объемом 5 миллилитров из каждой культуры, осторожно встряхивая колбу для равномерного распределения клеток.

Затем разлейте каждый образец в отдельные конические пробирки объемом 15 миллилитров. Чтобы оценить образцы методом анализа Copus, убедитесь, что компьютер системы Copus Plus Pump и аргоновый лазер с длиной волны 488 нанометров включены, после чего откройте программное обеспечение Bio Source. Убедитесь, что флакон с обтекающим потоком заполнен, а флакон для отходов пуст, затем нажмите «start and run».

Чтобы переключить аргоновый лазер с длиной волны 488 нм из режима ожидания в рабочий режим, подождите примерно 60 секунд, пока лазер не будет готов. Нажмите «Готово» (done), а затем проверьте показатели манометров. Установите флажок рядом с пунктом «Давление» (pressure).

Хорошо, после того как система заполнит проточную кювету, убедитесь, что параметр задержки (delay) установлен на 11, а ширина (width) — на семь. Установите пороги на уровне 50 для сигнала и 40 для минимального времени пролета (time of flight minimum). Затем удалите остатки воды из кюветы для образца.

Добавьте примерно 50 миллилитров PBS, затем добавьте в кювету 0,1 миллилитра одного из образцов strep demy. Убедитесь, что кювета плотно закрыта, и нажмите «acquire», чтобы начать сбор данных. Регулируйте скорость потока так, чтобы при сборе не менее 2 500 событий скорость составляла от 30 до 50 событий в секунду.

Нажмите «stop» (остановка), а затем «store» (сохранить), чтобы сохранить данные для последующего статистического анализа при сортировке бактериальных осадков для каждого образца. Сначала установите пределы сортировки и введите данные о минимальном и максимальном значениях времени пролета. В качестве альтернативы выберите области, а затем определите область гейтирования (gate region), чтобы создать зону для выбора осадков с заданными размерами и свойствами.

Поместите пробирку объемом 50 мл для сбора гранул, соответствующих параметрам сортировки. Затем установите количество сортируемых гранул и нажмите «sort manually» (сортировать вручную) для проведения сортировки по выбранным параметрам. После завершения сортировки удалите остатки образца и дважды промойте стакан для образца водой.

Перед выключением корпуса очистите кювету для образца 70% ethanol. Затем дважды запустите систему: один раз с хлорированной водой и один раз с обычной водой, после чего опорожните контейнер для перелива. После очистки нажмите «стоп», чтобы сбросить давление в системе.

После остановки двигателя закройте программу и нажмите «выключить без продувки» (shut down without purging). Затем выключите компьютер, систему COPA, лазер и насос. Мицелиальные пеллеты и жидкие культуры имеют широкий диапазон размеров.

Для анализа распределения гранул по размеру двухдневную культуру streptomyces cila color, выращенную в жидкой среде, подвергли проточной цитометрии крупных частиц с использованием Copus Plus Profiler, оснащенного соплом диаметром 1 мм. Здесь представлен типичный график рассеяния, полученный на Copus. Ось x представляет время пролета.

Чем больше размер частицы, тем больше времени требуется для прохождения лазерного луча. Ось Y отображает экстинкцию, которая соответствует оптической плотности объекта; каждая точка соответствует одной частице, проходящей через лазерный луч. Построение гистограммы по полученным данным показало, что размеры объектов в этой репрезентативной выборке были распределены ненормально.

Распределение имело выраженную правостороннюю асимметрию по логарифму. Логарифмическое преобразование набора данных также не привело к нормальному распределению. Чтобы определить, можно ли объяснить распределение размеров, предположив смесь двух нормальных распределений, данные были подвергнуты математическому моделированию. Моделирование действительно указало на наличие популяции мелких гранул, составляющей 92% от всех гранул со средним размером 248 micrometers, и популяции крупных гранул, составляющей 8% от всех гранул со средним размером 319 micrometers.

Здесь представлен репрезентативный анализ микроколоний, отсортированных из популяций крупных и мелких пеллетов. Средние размеры пеллетов двух популяций использовались для определения границ сортировки, чтобы ограничить попадание пеллетов из перекрывающейся части двух распределений размеров: пеллеты размером менее 248 micrometers считались относящимися к популяции мелких пеллетов, тогда как пеллеты размером более 319 micrometers считались относящимися к популяции крупных пеллетов. Микроскопический анализ отсортированных пеллетов подтвердил их отчетливую разницу в размерах после применения данной процедуры.

Для раскрытия механизмов, лежащих в основе этой гетерогенности, могут быть использованы другие методы, такие как секвенирование следующего поколения или протеомика.