Сортировка Streptomyces Сотовые Пеллеты Использование сложного объекта Параметрический Analyzer и сортировщик

Общая цель этой процедуры заключается в сортировке мицелиальных гранул, образованных нитчатыми стрептомицетами, по размеру с помощью проточного цитометра COPA с большими частицами. Это достигается в первую очередь путем выращивания и последующего отбора проб нужного штамма бактерий. На втором этапе деформация образца измеряется коппой.

Затем данные анализируются in silico, и гранулы мицелия сортируются в соответствии с параметрами, заданными пользователем. В конечном счете, эти анализы могут быть использованы для дальнейшей характеристики неоднородности гранул по размеру. Хотя этот метод может быть использован для стрептомицетов, он также может быть применен к другим организмам, таким как нитчатые грибы, демонстрируя эту процедуру Марус Петрус, аспирант из нашей лаборатории.

Сначала выращивают культуры, добавляя 100 миллилитров дрожжевого экстракта, солодовой экстрактной среды и 0,2 миллилитра 2,5 моляра хлорида магния в одну стерильную 250-миллилитровую колбу Эрленмейера, снабженную металлическими спиральными пружинами для каждого образца бактерий. Затем инокулируйте в каждую колбу от 10 до 10 до 8 спор streptomyces, чтобы получить концентрацию спор от 1 до 10 до шести спор на миллилитр, и выращивайте бактерии при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 180 оборотах в минуту. Через два дня с помощью стерильной пятимиллилитровой пипетки соберите пятимиллилитровую пробу из каждой культуры, осторожно встряхивая колбу, чтобы равномерно распределить клетки.

Затем разложите каждый образец по отдельным коническим пробиркам объемом 15 миллилитров. Чтобы оценить образцы с помощью анализа copus, убедитесь, что компьютер copus plus pump включены и аргоновый лазер 488 нанометров, а затем откройте программное обеспечение bio source. Убедитесь, что бутылка с жидкостью в футляре заполнена, а бутылка для отходов пуста, а затем нажмите кнопку «Пуск» и «Запустить».

Для переключения аргоннического лазера с яркостью 488 нм из режима ожидания во включенное примерно через 60 секунд лазер будет готов. Нажмите, готово, а затем проверьте манометры. Установите флажок рядом с пунктом «Давление».

Хорошо, а затем, после того как система подготовит ячейку потока, подтвердите, что настройка задержки равна 11, а ширина равна 7. Установите пороговые значения на 50 для сигнала и 40 для минимального времени полета. Затем удалите остатки воды из чашки для проб.

Добавьте около 50 миллилитров PBS, а затем добавьте в чашку 0,1 миллилитра одного из образцов стрептококка. Убедитесь, что чашка правильно закрыта, а затем нажмите «Получить», чтобы начать сбор данных. Управляйте скоростью потока, чтобы получать от 30 до 50 событий в секунду, когда было собрано не менее 2 500 событий.

Нажмите, остановите, а затем сохраните, чтобы сохранить данные для последующего статистического анализа для сортировки бактериальных гранул для каждого образца. Сначала установите пределы сортировки и введите данные о минимальном и максимальном значениях времени полета. Либо выберите области, а затем определите область затвора, чтобы создать область для выбора гранул с нужными размерами и свойствами.

Поместите трубку объемом 50 миллилитров для сбора гранул, которые соответствуют параметрам сортировки. Затем установите количество гранул для сортировки и нажмите «Сортировать» вручную, чтобы отсортировать по выбранным параметрам. После сортировки удалите остатки образца и дважды промойте чашку с образцом водой.

Перед выключением чашки очистите чашку с образцом 70% этанолом. Теперь запустите систему дважды. Один раз хлорированной водой и один раз простой водой, затем опорожните переливной контейнер После очистки нажмите стоп, чтобы сбросить давление в системе.

Когда мотор остановится, закройте программу и нажмите кнопку «Выключить» без продувки. Затем выключите компьютер, копа, лазер и накачку стрептомицетов. Мицелиальные гранулы и жидкие культуры, которые имеют широкий диапазон размеров.

Для анализа распределения гранул по размерам двухдневную жидкую культуру цвета streptomyces cila подвергали проточной цитометрии с большими частицами с помощью профилографа copus plus, оснащенного соплом диаметром в один миллиметр. Здесь показана типичная диаграмма рассеяния выходных данных copus. Ось x представляет время полета.

Чем больше апелляция, тем больше времени требуется для прохождения лазерного луча. Ось Y указывает на затухание, которое представляет собой оптическую плотность объекта, каждая точка в котором соответствует одной грануле, проходящей через лазерный луч. Нанесение точек данных на гистограмму показало, что размеры из этой репрезентативной выборки не были нормально распределены.

Распределение оказалось смещенным в сторону правого бревна. Преобразование набора данных также не привело к нормальному распределению, чтобы оценить, можно ли объяснить распределение размеров, предположив смесь двух нормальных распределений, данные были смоделированы математически. Моделирование действительно показало популяцию мелких гранул, составляющих 92% всех гранул со средним размером 248 микрометров, и популяцию крупных гранул, составляющих 8% всех гранул со средним размером 319 микрометров.

Здесь показан репрезентативный анализ микроколоний, отсортированных из больших и малых популяций пеллет. Средние размеры гранул двух популяций использовались для определения границ сортировки таким образом, чтобы ограничить сортировку гранул из перекрывающейся части двух распределений по размерам: гранулы размером менее 248 микрометров считались из малой популяции гранул, в то время как гранулы размером более 319 микрометров считались из популяции крупных гранул. Микроскопический анализ отсортированных гранул подтвердил их различные размеры после этой процедуры.

Другие методы, такие как секвенирование нового поколения или протеомика, могут быть выполнены, чтобы разгадать основные механизмы этой гетерогенности.