Снизу вверх и дробовик протеомики для идентификации Комплексную Cochlear Proteome

Общая цель данного эксперимента заключается в том, чтобы получить наибольшее количество идентификаций белков из кохлеарного сенсорного эпителия с использованием различных протеомных методов. Это достигается путем выделения улитки, сенсорного эпителия от взрослых мышей и ультразвука в буфере для лизиса для получения белка в качестве второго этапа. Различные стратегии разложения применяются к цельному лизату или к фракционированному лизату белка с целью увеличения покрытия пептидов и белковых последовательностей.

Кроме того, используются различные методы разделения, в том числе сильный катионный обмен и обращенно-фазовая хроматография для снижения сложности образца перед масс-спектрометрическим анализом. Результаты показывают идентификацию большого количества мембранных и растворимых белков для сенсорного эпителия улитки мышей с использованием нескольких протеомных подходов и масс-спектрометра высокого разрешения. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как микрочип антител и двумерный гель-электрофорез, заключается в том, что идентифицируется большое количество как растворимых, так и мембранных белков, что увеличивает данные кохлеарного протеома.

Хотя этот метод может дать представление о биомаркерах, связанных с нарушениями слуха и слезотечения, он также может быть применен к другим системам, таким как идентификация биомаркеров, связанных с возрастом и раком молочной железы или легких. Этот метод также может быть применен для изучения других биологических образцов, таких как кровь. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы наблюдали ограниченный набор данных протеомного данных, доступный из внутреннего уха млекопитающих, и, в частности, ограниченное количество мембранных белков, которые были идентифицированы до начала этой процедуры.

Изолируйте кохлеарный сенсорный эпителий от мышей на 30-й день после рождения. После промывки ткани одним х фосфатным буфером добавьте в ткань 100 микролитров буфера для лизиса и обрабатывайте смесь ультразвуком в течение 30 секунд на льду с помощью звукового расчленителя. Охладите лизат на льду в течение одной минуты между каждым ультразвуковым обработкой, затем обработайте образец ультразвуком в общей сложности три раза.

Centra сплавляла суспензию при 16 000 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Когда закончите, сохраните надосадочную жидкость для пищеварения. После этого добавьте 30 микролитров аликвоты экстракта кохлеарного белка непосредственно в спин-фильтр 30 К и смешайте с 200 микролитрами восьмимолярной мочевины в центрифуге Riss HCL.

Смесь при 14 000 раз G в течение 15 минут. По окончании разбавьте концентрат 200 микролитрами восьмимолярного раствора мочевины и повторите центрифугирование, используя те же условия, что и раньше. Далее добавьте 10 микролитров 10 XI ото-ацетамида и 90 микролитров восьмимолярного раствора мочевины в концентрат в фильтр и заверните на одну минуту.

После помещения спинового фильтра в штатив для микроцентрифуг инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте после центрифугирования при 14 000 G в течение 10 минут при концентрации 0,1 мкг на микролитр эндопротеазы С в соотношении ферментов к белку один к 50 и инкубируйте смесь в течение ночи при 30 градусах Цельсия. По окончании добавьте в фильтрующий блок 40 микролитров 100 миллимолярного раствора бикарбоната аммония и центрифугируйте смесь при 14 000 G в течение 10 минут. Затем дважды промойте фильтрующий блок 40 микролитрами воды milli Q.

После того, как фильтрующий блок был трижды промыт 100 микролитрами 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония, добавьте 0,4 микрограмма на микролитр трипсина в соотношении один к 100 ферментам и белка и инкубируйте смесь в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации элюируйте триптиды, добавив 40 микролитров 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония в фильтрующую установку, и центрифугируйте смесь при 14 000 G в течение 10 минут. Затем повторите этот шаг еще раз.

На этом этапе введите от 50 до 100 микрограммов переваренного образца белка в пятимикрометровую катионобменную колонку размером 200 на 2,1 миллиметра с интенсивностью 5 микрометров. С помощью сборника фракций затем высушите фракции в вакуумном концентраторе. Когда закончите, храните высушенные фракции при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию для жидкостной хроматографии.

Тандемный масс-спектрометрический анализ. В другом подходе для разделения белковой смеси использовалось фракционирование без геля. После того, как надосадочная жидкость кохлеарного белка будет обессолена с помощью осаждения ацетона, добавьте 30 микролитров буфера из пяти образцов к обессоленному белку, предварительно взвешенному в 112 микролитрах воды Milli Q.

Затем добавьте восемь микролитров одного моляра DTT и нагрейте смесь до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы уменьшить дисульфидные связи белка. После нагревания дайте смеси остыть. Добавьте восемь миллилитров рабочего буфера в резервуар анода, 150 микролитров буфера в камеру сбора проб и шесть миллилитров буфера в резервуар катода.

После этой загрузки 150 микролитров смеси кохлеарного белка в камеру загрузки образца с использованием картриджа с 8% трисацетатом с диапазоном масс от 3,5 до 150 килодальтон. После начала прогона соберите образец из камеры для сбора проб через каждый интервал времени на приборе с помощью пипетки и добавьте в только что помеченную микропробирку. Затем дважды промойте камеру сбора 150 микролитрами проточного буфера и выбросьте.

После 1D гель электрофорез свободных фракций геля. Добавьте каждую отдельную фракцию непосредственно в фильтр 30 К. Затем смешайте каждую фракцию с 200 микролитрами восьмимолярной мочевины в трис HCL после центрифугирования при 14 000 G в течение 25 минут, добавьте 10 микролитров 10 XI ото-ацетамида в растворе мочевины в концентрат в каждой фильтровальной установке и сделайте вихрь в течение одной минуты.

После помещения спиновых фильтров в штатив для микроцентрифуг инкубируйте образцы в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем добавьте 0,1 микрограмма на микролитр LY C для соотношения ферментов к белку один к 50 в фильтрующие блоки после ночной инкубации при 30 градусах Цельсия, добавьте 40 микролитров 100 миллимолярного раствора бикарбоната аммония в спин-фильтры и центрифугируйте образцы при 14 000 G в течение 10 минут после однократного повторения предыдущего шага. Промойте отжимные фильтры три раза 100 микролитрами 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония, добавьте 0,4 микрограмма на микролитр трипсина в соотношении ферментов к белку один к 100 после окончательной промывки. После того, как образцы были инкубированы в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия, вымывайте пептиды триптидов из каждой фильтрующей установки, добавляя 40 микролитров 50 миллимолярного раствора бикарбоната аммония, и центрифугируйте образцы при 14 000 перегрузках в течение 10 минут.

Повторив это, сделайте один шаг, проанализируйте образцы с помощью жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии. Применялись две процедуры двойного пищеварения. Первое представляло собой триптиховое разложение, за которым последовало второе разложение с трипсином, которые были объединены фракционированными на сильной катионообменной колонке на 18 фракций и проанализированы с помощью тандемной масс-спектрометрии с помощью наножидкостной хроматографии.

В общей сложности 1 485 белков были идентифицированы с 1% FDR при выполнении тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии за один прогон. Использование этого экспериментального подхода. Среди идентифицированных белков 324 и 258 белков были классифицированы по митохондриям и плазматическим мембранам соответственно.

Вторая процедура двойного пищеварения состояла из расщепления lys C с последующим расщеплением трипсина. Каждый дигест был индивидуально загружен и разделен на сильной катионобменной колонке на 18 фракций, а также проанализирован с помощью тандемной масс-спектрометрии с помощью наножидкостной хроматографии. В результате расщепления LY C и трипсина было получено в общей сложности 3503 белка с 1% FDR.

Кроме того, 605 и 617 белков были классифицированы по митохондриям и плазматическим мембранам соответственно. Такой подход обеспечил наибольшее количество идентификаторов мембраноассоциированных белков. Повторный анализ LY C и трипсина.

Дроби показали, что более 65 идентифицированных белков были общими для экспериментов. Тем не менее, в реплицитном анализе были также обнаружены новые белки. Дополнительные пептиды и белки были идентифицированы благодаря небольшим изменениям в хроматографии, что привело к фрагментации различных пептидов.

Гель для серебряного окрашивания был приготовлен для визуализации результатов фракционирования без геля, как показано на рисунке. Здесь гель показал разделение белков за счет увеличения молекулярной массы для каждой последующей фракции. Таким образом, 12 свободных гелевых жидких фракций были расщеплены с использованием двух различных многогранных подходов к разложению и проанализированы с помощью тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии.

Первый подход к расщеплению был выполнен с использованием двойного расщепления трипсина, что привело к идентификации 2 165 белков с 1% FDR при выполнении тандемной масс-спектрометрии с одним прогоном жидкостной хроматографии. В этом эксперименте 516 и 399 белков были классифицированы по митохондриям и плазматическим мембранам соответственно. Второй подход к расщеплению был выполнен с использованием эндопротеиназы ly C с последующим расщеплением трипсина, однопрогонной жидкостной хроматографией.

Тандемный масс-спектрометрический анализ выявил 2 211 белков с 1% FDR. Этот подход показал такое же количество мембраноассоциированных белков, как и при использовании трипсин-трипсина, данные масс-спектрометрии протеомики были переданы в Proteome Exchange Consortium с идентификатором набора данных PXD 0 0 0 2 3 1. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости избегать загрязнения на каждом этапе и держать ткань на льду при выполнении экстракции белка, чтобы избежать деградации белка.