В Vivo визуализация пространственного распределения опухолей головного мозга и артрита использованием флуоресцентных SAPC-DOPS Nanovesicles

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы выполнить 360-градусную визуализацию мыши in vivo для определения оптимального угла для флуоресцентного анализа. Это достигается путем предварительной подготовки ортотопической опухоли головного мозга, инженерной опухоли мозга и животных моделей артрита. Затем производится белок SAP C и готовятся нановезикулы SAP D-O-P-S-C-V-M.

Затем нановезикулы вводятся в хвостовую вену животных. Наконец, снимаются и анализируются флуоресцентные и рентгеновские изображения. В конечном счете, метод M-A-R-O-I используется для отображения оптимального угла для анализа флуоресцентной визуализации.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как 2D планарная флуоресцентная визуализация, заключается в том, что метод M-A-O-M-A-R-O-I позволяет исследователям определить оптимальный угол для анализа флуоресцентной визуализации. Применение этой технологии распространяется на терапию и диагностику рака и артрита, поскольку CEP CS Vesical может воздействовать на опухоль и воспалительные ткани. Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Цинциннати и Исследовательским фондом детской больницы Цинциннати для проведения этих исследований и ортотопических опухолей головного мозга мышей.

В соответствии с текстовым протоколом, используйте макроскопическую систему оценки артрита у мышей с артритом следующим образом: ноль означает отсутствие обнаруживаемого артрита, единица означает отек и/или покраснение лапы, или одна цифра два равна двум пораженным суставам. Три равны трем вовлеченным суставам и четырем равным тяжелому артриту всей лапы и пальца продуцируют рекомбинантный человеческий белок С САП в клетках кишечной палочки до осаждения этанолом и высокоэффективной жидкостной хроматографической очисткой после лиофилизации определяют концентрацию сухого САП С по весу. Чтобы смешать белок SAP C, соедините 0,18 мг DOPS и 0,03 мг CVM в стеклянной трубке и используйте газообразный азот для испарения липидных растворителей.

Затем добавьте в смесь 0,32 миллиграмм порошка морского белка САП. Суспензируйте суспензию сухой смеси в одном миллилитре PBS буфера и ванны сопрокиньте на 15 минут. Пропустите суспензию через колонку Cidex G 25, чтобы удалить свободный краситель CVM.

Наночастицы SAP C-D-O-P-S-C-V-M будут иметь максимумы возбуждения и излучения 653 нанометра и 677 нанометров соответственно. Для тестирования многоракурсной ротационной оптической визуализации или метода M-A-R-O-I с использованием системы Mars, после обезболивания мыши из одной из описанных моделей мышей с фтором 2% ISO положение мыши в лежачем положении в системе Mars с направленным в сторону камеры позвоночником с экрана предварительного просмотра вращательной вкладки brucker MI, калибровать опорную пленку Mars 380 градусов. Чтобы расположить мышь для введения SAP C-D-O-P-S-C-V-M в хвост мыши, введите 200 микролитров внутривенно через 24 часа, а затем снова через семь-девять дней после инъекции, сделайте флуоресцентные и рентгеновские снимки с шагом 10 градусов в течение 380 градусов, создавая небольшое перекрытие, чтобы гарантировать отсутствие пробелов во вращающемся наборе данных.

С помощью программного обеспечения Bruker для вращения флуоресцентные изображения накладываются на рентгеновские изображения для анатомической локализации. Чтобы проанализировать изображения, нарисуйте прямоугольную область интереса, или ROI, охватывающую ширину поля зрения, или поле зрения участка заболевания у мышей с опухолью головного мозга. Используйте один и тот же ROI для каждой модели опухоли и соответствующих контрольных мышей для всех временных точек, используя анатомические ориентиры, чтобы отметить положение ROI после автоматического вычитания фона.

Определите среднюю интенсивность флуоресценции для каждого изображения с помощью программного обеспечения Brucker MI для преобразования флуоресцентных изображений в фотоны в секунду на миллиметр в квадрате, построения графика значений флуоресценции в зависимости от углов изображения и применения в качестве планок погрешности. Стандартное отклонение средних значений флуоресценции, полученных от контрольных мышей. Флуоресцентное изображение репрезентативной ортотопической мыши с опухолями показано на этом рисунке.

Мы демонстрируем, что затравочные нановезикулы DOPS, меченные дальним красным красителем, специфически накапливаются в ортотопических и спонтанных опухолях головного мозга мышей, а также в артритных суставах мышей KBXN. Основной целью марсианской системы является определение оптимального угла флуоресценции, чтобы можно было провести наиболее точные измерения, как показано здесь. Оптимальный угол изображения для этого животного – 10 градусов.

Положение, при котором интенсивность флуоресцентных фотонов является наибольшим, исходные измерения были проведены до введения SAP C-D-O-P-S-C-V-M, а через 24 часа после инъекции контрольные мыши без опухоли получали аналогичное лечение. Эти цифры показывают сопоставимые данные с помощью генетически модифицированной модели опухоли головного мозга у мыши. Флуоресцентные изображения и фотонные измерения были получены на исходном уровне через 24 часа и девять дней после инъекции SAP C-D-O-P-S-C-V-M.

Графики показывают, что оптимальный угол визуализации у животного-носителя опухоли немого 49 составляет 20 градусов через 24 часа после инъекции, но изменяется до 10 градусов через девять дней после инъекции. Это говорит о том, что изменение флуоресцентного сигнала коррелировало с морфологическими изменениями, вероятно, отражающими рост опухоли. Как показано в этой таблице, метод M-A-R-O-I ясно демонстрирует, что флуоресцентный сигнал уменьшается для проекций при увеличении угла поворота от оптимального угла изображения.

При опухолях головного мозга было получено снижение флуоресцентного сигнала в среднем на 7%. Если физическая ориентация животного была смещена более чем плюс-минус 10 градусов от оптимального угла съемки. В среднем снижение флуоресцентного сигнала на 21% было зафиксировано при температуре плюс-минус 20 градусов.

Таким образом, относительно небольшие смещения от оптимального угла могут привести к значительному процентному снижению сигнала. Использование метода M-A-R-O-I для позиционирования изображений позволит исследователям получать более согласованные и надежные данные. Метод M-A-R-O-I был окончательно использован для оценки нацеливания на артритные суставы SAP C-D-O-P-S-C-V-M через 24 часа после инъекции.

Это животное набрало три балла с тремя артритными суставами. Флуоресцентные изображения пальца ноги и лодыжки мыши, страдающей артритом, показаны здесь на основе графиков соответствующих измерений фотонов При вращении на 10 градусов оптимальные углы изображения для пальца ноги и лодыжки составляют 140 градусов и 120 градусов соответственно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить и получить данные M-A-R-O-I, которые позволят исследователям определить оптимальный угол для анализа флуоресцентной визуализации.