Визуализация нейробласта Цитокинез Во С. Элеганс Эмбриогенеза

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы наблюдать за делением клеток в развивающейся ткани во время эмбриогенеза C. elegance. Для изучения генов, контролирующих деление клеток, это достигается путем создания или получения штамма C. elgan, стабильно экспрессирующего трансгенные маркеры, маркирующие интересующие клетки. В качестве второго шага селективно сбивайте интересующий вас ген, скармливая D-S-R-N-A четырем личинкам L в течение 24-48 часов.

Эмбрионы RNAI собираются из графических гермафродитов и переносятся на площадку aros для визуализации в реальном времени. Затем с помощью широкоугольной или конфокальной микроскопии эмбрионы визуализируются для визуализации фенотипов деления клеток. Результаты покажут, как происходит деление нейробластов во время эмбриогенеза морского эльгина, и роль генов, необходимых для их деления.

Этот метод может помочь выявить ключевые вопросы в области биологии развития и клеточной биологии. Например, этот метод может выявить гены и механизмы, которые участвуют в регуляции митоза во время развития тканей, клеточной коммуникации, миграции клеток или клеточной полярности. Используйте трансгенных червей, экспрессирующих соответствующие маркеры, которые хранятся на контрольных или RNAI-планшетах в течение 24–48 часов.

Выберите от четырех до шести взрослых особей и перенесите их в буфер от 20 до 30 микролитров M nine в предметное стекло Чтобы освободить эмбрионы, используйте стерильный скальпель, разрежьте червей по обе стороны от сперматеки или вульвы. Далее соберите эмбрионы с помощью вытянутого капилляра, который прикреплен к колбе пипетки и достаточно широк, чтобы пропустить эмбрионы. Перенесите эмбрионы на свежеприготовленную подушечку с помощью ресницы, приклеенной к зубочистке.

Создавайте группы от 5 до 10 эмбрионов, толкая эмбрионы рядом друг с другом. Закройте затвор защитным стеклом и при необходимости добавьте еще буфер M nine, затем запечатайте защитное стекло предварительно нагретой жидкостью valla. Используйте эпифлуоресцентный широкоугольный микроскоп с автоматическими фильтрами.

Объективы, ПЗС-камера высокого разрешения и высокомоторизованный стол. Все контролируется программным обеспечением. Хотя в этой системе их нет, использование светодиодов и E-M-C-C-D ограничит фототоксичность для эмбриона при малом увеличении.

Вручную сфокусируйтесь на эмбрионах, чтобы получить изображение нейробласта. Увеличьте увеличение и выберите эмбрионы, подвергающиеся дорсальному взаимодействию или раннему вентральному закрытию на широкопольном микроскопе. Выберите фильтры GFP и Texas red и определите оптимальные плоскости Z в широкопольной системе.

Использование меньшего количества Zacks и меньшего количества временных точек снизит фототоксичность, а также закроет апертуру до 30%, и, если возможно, уменьшение интенсивности света еще больше снизит фототоксичность. В качестве альтернативы можно использовать конфокальный микроскоп с разверткой в реальном времени или конфокальный микроскоп с вращающимся диском с программным обеспечением, управляющим объективами сканирующих лазеров, камеру E-M-C-C-D и высокомоторизованный столик. Теперь, когда настройки сбора данных оптимизированы, можно получить изображение эмбрионов на широкоугольном микроскопе.

Рекомендуется сначала провести пленочный контроль эмбрионов перед РНКИ эмбрионов. С системой стреловидного поля. Установите 4 88 и 5 61 100 милливаттных лазеров на мощность 40% с щелью 50 и временем экспозиции 300 миллисекунд.

Важно отметить, что для других микроскопов эти настройки будут отличаться. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа, затем используйте объектив с низким увеличением, чтобы найти эмбрионы. Затем переключитесь на объектив погружения в масло 60 или 100 раз.

После фокусировки собирайте 20 стеков Z с точностью 0,2 микрона каждые две минуты в общей сложности 10 минут. Время экспозиции, скорее всего, потребует настройки. Фототоксичность необходимо учитывать при визуализации живых эмбрионов с помощью флуоресцентной микроскопии, закрывая апертуру, выбирая меньшее количество Zacks или временных точек.

Уменьшение времени воздействия может ограничить фототоксичность, если это возможно. Использование SW-поля или конфокального микроскопа с вращающимся диском может помочь решить эту проблему. Определите интересующее вас время, точки и плоскости Z с помощью программного обеспечения для сбора данных.

Экспортируйте нужные изображения в виде нескольких tiff. Откройте нужные Z-плоскости для каждой интересующей точки времени и интересующего вас канала в обрабатывающем программном обеспечении, таком как Image J, и создайте стек нейробласта, который часто охватывает только несколько плоскостей. Сложите плоскости Z для каждой временной точки и создайте проекции стека Z.

Повторите это для дополнительных каналов. После того, как все проекции Зака для желаемых временных точек будут завершены, откройте проекции, чтобы создать временную последовательность. Делайте это для каждого канала отдельно.

Для каждого канала при необходимости настройте яркость и контрастность. При необходимости поверните изображения. Затем выберите интересующую область и обрежьте изображения.

Теперь создайте объединенное изображение с помощью функции объединенных каналов. Выбираем свой цвет для каждого канала. Сохраните объединенное изображение в виде файла RGB, чтобы визуализировать изображения более четко.

Используйте 16-битные изображения в формате TIFF и выберите функцию инвертирования в разделе «Редактирование», чтобы создать изображения в оттенках серого для каждого канала. Чтобы определить размер интересующего объекта с точностью до микрона, проведите линию и умножьте ее длину на размер пикселей, который определяется параметрами изображения. Теперь создадим масштабную линейку, которая представляет собой пропорцию вычисленной длины в микронах.

В конечном итоге, сохраните окончательные изображения в виде восьмибитных тиффов. При желании конвертируйте тиффы в фильмы с помощью изображения J эпидермальный. Морфогенез C. elegance происходит из-за сочетания изменений формы эпидермальных клеток, миграции и адгезии с помощью лежащего в основе пролиферативного нейробласта.

Эпидермальные клетки мигрируют к вентральной средней линии и образуют единый слой клеток для изучения эмбрионов с делением нейробластов, стабильно экспрессирующие коэкс и специфичный маркер нейробластов, меченный GFP, и маркер мембраны, управляемый матерью, меченный вишней, визуализировались во время вентрального окружения при увеличенном увеличении. Нейробласты были визуализированы при делении, ядра нейробластов показаны зеленым цветом, а окружающие мембраны показаны красным цветом, покадровые изображения делящегося нейробласта, очерченные мембранным зондом mCherry в контрольном эмбрионе, были захвачены с помощью широкоугольного микроскопа для лучшей визуализации делящегося нейробласта у контрольных эмбрионов. Каждый канал был сохранен в оттенках серого, а изображения были инвертированы с помощью контрольной конфокальной микроскопии с разверткой.

Коэкс, экспрессирующий ветчину one GFP и M cherry pH, был визуализирован в области с делящимся нейробластом. Те же самые эмбрионы, обработанные РНКИ для подавления болезненной экспрессии, были визуализированы с помощью широкопольной микроскопии. В отличие от контрольных эмбрионов, многие нейробласты останавливались или регрессировали во время деления и становились многоядерными с помощью микроскопии с разверткой поля.

Также было ясно, что многие нейробласты остановились или регрессировали во время деления и стали многоядерными. Этот метод также может быть использован для визуализации мигрирующих клеток во время формирования тканей. Кроме того, если ваши Zacks используются для более быстрой визуализации, можно получить больше информации о субклеточной динамике.

Кроме того, при наличии соответствующего оборудования этот метод может быть использован для активации фотонастраиваемых зондов для выполнения оптогенетических исследований. Кроме того, методы микроскопии, такие как лад или лад, могут быть применены для изучения белка, белковых взаимодействий или динамики белка.