Оценивая развитие мышей плазмацитоидных дендритных клеток в пейеровых бляшках Использование приемных передачи гемопоэтических прародителей

Общей целью данной процедуры является изучение способности очищенных гемопоэтических предшественников давать начало плазмоцитоидным дендритным клеткам в кишечных заплатках при адоптивном переносе. Это достигается путем предварительного выполнения гидродинамического переноса гена плазмиды, кодирующей фактор роста дендритных клеток. FLIT три лиганда в плазмоцитоидные плазмоцитоидные клетки PI у мышей, поврежденных дендритными клетками.

На втором этапе общие дендритные клетки-предшественники выделяются из костного мозга дикого типа путем разделения магнитных шариков и сортировки в потоке. На заключительном этапе клетки-предшественники адоптивно переносятся путем внутривенной инъекции в плазмоцитоидные клетки мышей с нарушением плазмоцитоидных дендритных клеток, которых лечили с помощью гидродинамического переноса генов. В конечном счете, популяция плазмоцитоидных дендритных клеток PI, полученная из донорских гемопоэтических клеток-предшественников, может быть оценена с помощью проточной цитометрии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, каково происхождение плазменных клеток Cy Dendri, которые локализуются в пиратских пятнах. Хотя этот метод может дать представление о происхождении плазмоцитоидных дендритных клеток пирового пятна. Это также может быть применено для понимания того, как плазмоцитоидные дендритные клетки влияют на популяции лимфоцитов в этих тканях.

За два дня до адоптивного переноса расширяют кровеносные сосуды пяти мышей-реципиентов с нокаутом рецептора CD 45 с положительным интерфероном альфа под тепловой лампой в течение 5-10 минут. Затем для каждой мыши поместите животное в удерживающее устройство и продезинфицируйте хвост 70%-ным этанолом. Затем с помощью иглы 27 калибра введите пять микрограммов плазмы и проведите три лиганда и два миллилитра стерильного PBS в хвостовую вену каждого животного.

Для контрольной группы введите пять микрограммов пустого вектора. После наблюдения за мышами в течение 15-30 минут верните их в помещение. В день эксперимента поместите рассеченные бедренную и большеберцовую кости от 10 конгенных CD 45 1 положительного C 57 черных шести мышей в чашку для культивирования, содержащую полную среду.

Затем вставьте иглу 27 калибра в один конец каждой кости и с помощью сплошной среды промывайте костный мозг в чашке три раза на каждую кость. Убедитесь, что клетки костного мозга удаляются, убедившись, что выведенная среда выглядит мутной. Приготовьте суспензию для одной клетки, осторожно пипетируя среду вверх и вниз от трех до пяти раз в чашке для культивирования.

Затем удалите мусор, пропустив клетки костного мозга через клеточный фильтр 40 микрометров, и разрушьте любые скопления клеток, аккуратно применив конец стерильного поршня шприца. На ситечке раскрутите вниз клетки, удалите надосадочную жидкость и влагу эритроцитов в два миллилитра буфера для лизиса на четыре-шесть раз по 10-7 клеток в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем добавьте 10 миллилитров факс-буфера в клетки костного мозга и вращайте в течение четырех минут при температуре 500 G при комнатной температуре.

После легкой аспирации супнатина промойте гранулу в 10 миллилитрах факс-буфера. Затем окрашивают клетки маркером гемопоэтической линии, распознающим антитела, после окрашивания антител и промывки. Инкубируйте клетки с козьими антикрысиными магнитными микрогранулами.

Во время инкубации микрогранул загрузите колонку max LD в сепаратор ячеек MIDI max и предварительно промойте колонку двумя миллилитрами факс-буфера. Затем поместите под колонну коническую трубку объемом 15 миллилитров и загрузите до пяти раз по 10 до восьмой ячейки в 2,5 миллилитра факса буфера к колонке. Промойте колонку три раза двумя миллилитрами факс-буфера за одну промывку, собирая отрицательные клетки, которые проходят через колонку, в 15-миллилитровую трубку.

Подсчитайте ускользающие клетки. Затем, после окрашивания клеток соответствующими флуоресцентно конъюгированными антителами, перенести образец в факсимильную трубку для сортировки общих дендритных предшественников на основе желаемого маркерного профиля. Соберите очищенные ячейки факса в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров готового носителя, а затем в конце прогона факса запишите абсолютное число отсортированных ячеек.

После вращения вниз клетки разбавляют один раз от 10 до пятой части очищенных общих дендритных предшественников на 100 микролитров общего объема стерильных PBS на мышь и аспирируют клеточные суспензии в один шприц, оснащенный иглами 27 калибра. Затем введите CD 45 1 положительные клетки-предшественники в хвостовую вену каждой мыши-реципиента CD 45 2 положительного интерферона альфа с нокаутом, как это было продемонстрировано через 7-10 дней после адоптивного переноса. Удалите кишечник из общей дендритной клетки-предшественника мышей, поместив ткани на смоченные в PBS бумажные полотенца.

Затем с помощью тонких щипцов и ножниц соберите все видимые участки костра вдоль стенки тонкой кишки. Обратите внимание, что пятна на костре часто структурно различаются даже в пределах одной мыши, поэтому позаботьтесь о том, чтобы все участки P'S были идентифицированы и препарированы. Промойте изолированные пластыри P'S три раза в чашке Петри, содержащей PBS, с помощью щипцов для удаления кала.

Затем расщепите пластыри P'S с содержанием одного миллиграмм на миллилитр, коллагеназы четыре на 10 миллилитров HBSS в колбе объемом 50 миллилитров при энергичном перемешивании при температуре 37 градусов Цельсия. Через час вылейте переваренные пластыри PIs в клеточный фильтр 40 микрометров и с помощью стерильного поршня шприца надавите на клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. После раскрутки отфильтрованной клеточной суспензии повторно суспендируйте гранулу в шести миллилитрах раствора 37% на звонок и переложите ее в 15-миллилитровую пробирку.

Затем аккуратно нанесите шесть миллилитров раствора 70% на вызов, чтобы сформировать градиент шага на вызов. Теперь разделите ячейки на 20 минут при 800 умноженных на G при комнатной температуре с обрывом. Затем соберите популяцию мононуклеарных клеток на границе раздела.

После гранулирования собранных ячеек промойте их дважды в 50 миллилитрах готовой среды. Затем окрасьте их соответствующими антителами, чтобы обнаружить CD 45 1 положительный пластырь PYS. Плазмоцитоидные дендритные клетки, происходящие от адоптивно перенесенных CD 41-положительных предшественников.

Анализируйте клетки с помощью проточной цитометрии. Плазмоцитоидные дендритные клетки могут быть идентифицированы по их CD 11 C положительным clec H, положительному PDCA одному положительному B двум 20 положительным CD 11 B негативному фенотипу. Окончательно определите абсолютное число плазмоцитоидных дендритных клеток с помощью этого уравнения.

Эти точечные диаграммы указывают на стратегию стробирования для выделения общих дендритных предшественников. Для клеток костного мозга мыши, как только что было продемонстрировано, общие дендритные предшественники составляют примерно 0,1% от общего количества клеток костного мозга и примерно от четырех до шести умножить на 10 к четвертой. Из этих клеток можно выделить у одной мыши для идентификации плазмоцитоидных дендритных клеток PI с помощью проточной цитометрии.

Используется первоначальная стратегия прямого и бокового стробирования рассеяния, за которой следует стробирование для CD 11 C положительных клеток clec H. У мышей с нокаутом рецептора интерферона альфа наблюдается значительное снижение количества дендритных клеток плазмоцитоидного пятна по сравнению с мышами дикого типа. Обычные дендритные клетки-предшественники также дифференцируются в обычные дендритные клетки.

В отличие от плазмоцитоидных дендритных клеток, CD 11 C положительные clec H отрицательные обычные дендритные клетки наблюдаются в одинаковых количествах как у мышей дикого типа, так и у нокаутных мышей. Таким образом, мыши, нокаутирующие рецептор интерферона альфа, дают возможность исследовать восстановление плазмоцитоидных дендритных клеток PS-пластыря без эффектов летального облучения. Адоптивный перенос общих дендритных предшественников дикого типа в мышей с нокаутом рецептора интерферона альфа, как только что было продемонстрировано, стимулирует увеличение плазмоцитоидных дендритных клеток PIs.

Кроме того, предварительная обработка гидродинамическим переносом гена FL с тремя лигандами еще больше усиливает экспансию дендритных клеток плазмоцитоида в участках PI, что означает, что перенесенные общие дендритные предшественники и, возможно, эндогенные FL три положительные предшественники реагируют на FL три лиганда, индуцируя плазмоцитоидные дендритные клетки Pyrus Patch. Оба состояния также стимулируют производство CD 11 C положительного clec H отрицательного обычного дендритного клетка, что согласуется с происхождением развития обычных дендритных клеток. Плазмоцитоидные дендритные клетки пластыря PYS экспрессировали традиционные маркеры плазмоцитоидных дендритных клеток, включая clec H, PDCA one и B two 20 и LAC CD 11 B.In Кроме того, анализ патчей PYS от мышей с нокаутом рецептора интерферона альфа, которые получают как гидродинамический перенос гена FL, так и перенесенные общие дендритные предшественники, показывает, что около 70% плазмоцитоидных дендритных клеток получены от донорских CD 45 1 положительных общих дендритных предшественников.

В совокупности эти данные демонстрируют, что адоптивный перенос общих дендритных предшественников индуцирует популяцию плазмоцитоидных дендритных клеток PIs в ответ на сигналы, опосредованные тремя лигандами FL in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать и идентифицировать плазмоцитоидные D-клетки pars patch.