Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы наблюдать и характеризовать движения дуги глотки в развивающейся голове рыбки данио. Это достигается путем предварительного встраивания трансгенного эмбриона рыбки данио в анестезирующий гель акроста. Вторым шагом является установка внедренного агарозного эмбриона в каплю метилцеллюлозы на предметное стекло микроскопа.

Далее эмбрион запечатывается между двумя предметными стеклами микроскопа с помощью вакуумной смазки. В конечном счете, используется покадровая конфокальная микроскопия, чтобы показать различия между диким типом и мутантными рыбками данио, а также морфогенетические движения дуг глотки. Основное преимущество этого метода перед методами статической визуализации заключается в том, что он фиксирует развитие дуги глотки в режиме реального времени, что позволяет исследователю непосредственно наблюдать за движениями тканей, которые имеют решающее значение для морфогенеза.

Чтобы сделать мостовидную крышку, нанесите суперклей на покровное стекло 22 на 22 на каждый конец покровного стекла 24 на 60. Оставляем середину свободной. Делайте одиночные для эмбрионов возрастом менее суток.

Двойная для эмбрионов в возрасте от одного до четырех дней или тройная для эмбрионов в возрасте пяти дней и старше. И для каждого экземпляра используйте два мостовых покровных листка. Теперь наполните шприц объемом 10 миллилитров высоковакуумной смазкой.

Приготовьте свежий анестетик в 0,2% жидкости и поддерживайте в нагревательном блоке 42 градуса Цельсия. Чтобы вручную удалить оболочку из невылупившихся трансгенных эмбрионов, медленно разрывайте кориан до тех пор, пока эмбрион не освободится. Теперь перенесите покрытые оболочкой эмбрионы в чистую среду, содержащую MS 2, 22 и эстетическую.

Чтобы приготовить крышку с мостом, медленно вытолкните вакуумную смазку из шприца, образуя гладкую непрерывную бусину, которая прилегает к мостовидным протезам и краю крышки и находится внутри них. Выложите круг из 4%-ной метилцеллюлозы в середину моста, чтобы покрыть скользкость. Когда эмбрион будет обезболиваться, наберите его вверх в стеклянную пипетку.

Держите пипетку вертикально, чтобы эмбрион опустился на дно жидкости в пипетке. Затем переместите пипетку в агрораствор и дайте зародышу опуститься в арос, не выталкивая жидкость. Наберите немного агрораствора и зародыш в пипетку.

Затем изгоняют эмбрион в каплю раствора аро. Сверху метилцеллюлоза. Надавите на метилцеллюлозу вниз и сориентируйте эмбрион по желанию для визуализации, чтобы запечатать образец.

Положите один мостовой защитный листок поверх установленного лицевой стороной вниз. Равномерно прижмите обе стороны сэндвич-накладок до тех пор, пока мосты не войдут в прямой контакт, и агрос не приложит уплотнения к обоим покровным стеклам. Убедитесь, что эмбрион правильно ориентирован.

Потрите деревянным аппликатором вдоль стекла, чтобы сгладить трещины и зазоры в скорости вакуумной смазки. Сотрите излишки жира с краев. Активируйте конфокальный микроскоп и любые внешние лазерные устройства.

Также включите компьютер, подключенный к конфокальному микроскопу, и выберите пусковую систему и программное обеспечение для конфокальной визуализации. Затем опустите постановочную платформу конфокального микроскопа и сдвиньте линзы объектива с места. Замените стандартный столик на столик с электронным подогревом.

Включаем контроллер для нагреваемой сцены и выставляем температуру на 29,5 градусов по Цельсию. Поместите смонтированный образец на нагретую сцену. Переместите объектив с 20-кратным увеличением в нужное положение и поднимите платформу.

Затем активируйте излучатель видимого света и центрируйте голову эмбриона в поле зрения. Чтобы активировать флуоресцентные каналы, выберите длину флуоресцентной волны, которую необходимо обнаружить, и выберите таблицы поиска цвета для каждого канала. Для каждого флуоресцентного канала установите интенсивность лазера равной 10,0 и напряжение фотоумножителя в диапазоне от 600 до 700.

Чтобы уменьшить фон и увеличить собираемую флуоресцентную информацию, установите усреднение на два или четыре, а битовую глубину на 16 бит. Активируйте модули стека ZS и временных рядов. При необходимости отрегулируйте отверстие.

Задайте временной интервал и продолжительность эксперимента. Переведите камеру в режим реального времени. При необходимости отрегулируйте фокусировку и увеличьте интенсивность лазера.

Чтобы увидеть флуоресценцию. Установите цифровой зум на 0,6 для более широкого обзора. При желании.

Расположите сцену так, чтобы все интересующие вас структуры были видны и в поле зрения оставалось место для роста. Дорсально и спереди фокусируются через эмбрион к верхнему и нижнему пределам флуоресценции. Установите положение первого и последнего среза Zack на расстоянии не менее 100 микрометров или более от этих пределов.

Затем установите таблицу преобразования дисплея на индикаторы диапазона, чтобы флуоресцентные структуры выглядели оттенка серого, а остальная часть поля должна быть синей или черной. При необходимости увеличьте напряжение фотоумножителя до уровня, чуть ниже которого появляются насыщенные красные пиксели. Если флуоресцентные структуры кажутся красными, уменьшите интенсивность лазера и/или усиление до тех пор, пока они не приобретут оттенок серого.

При необходимости отрегулируйте смещение. Таким образом, области за пределами образца выделены синим цветом. Установите наименьший диаметр, который позволяет своевременно собирать изображения.

Интервал Z всегда должен быть установлен на рекомендуемое оптимальное расстояние для диаметра точечного отверстия, выполняйте короткие сканирования для проверки настроек, всегда используя как можно более низкую интенсивность лазера. Теперь запустите эксперимент в течение нужного периода времени. После этого извлеките зародыш из нагретой стадии и медленно отделите покровные стебли, погрузите крышку, слип и зародыш в эм в 30-миллиметровую чашку Петри.

С помощью стеклянной пипетки аккуратно смойте зародыш с покровного стекла и снимите покровное стекло с чашки Петри. Поместите эмбрион в инкубатор с температурой 28,5 градусов Цельсия, чтобы продолжить развитие. В конце экспериментов сделайте отдельные снимки Зака эмбрионов братьев и сестер, которые были размещены аналогично образцу в начале экспериментов, но были выращены в ЭМ и инкубаторе с температурой 28,5 градусов Цельсия.

При необходимости измерьте дуги глотки с помощью конфокального программного обеспечения или другого программного обеспечения для обработки изображений у эмбрионов дикого типа. Следуя за популяцией нервного гребня, дуги глотки удлиняются вдоль передних задних и дорсальных вентральных НЯ, двигаясь в ростральном направлении. На его переднем конце первая глоточная дуга образует верхнечелюстные и нижнечелюстные домены, разделенные оральной эктодермой, ключевые морфогенетические движения сильно нарушены у сглаженных мутантов.

Здесь седьмая дуга глотки не может мигрировать, чтобы перекрываться с большим количеством передних дуг к 48 часам после оплодотворения. Пять мутантов данио-рерио SM имеют многочисленные дефекты черепной морды. В этих статических конфокальных изображениях.

Сращения в вентральных доменах второй и третьей дуг заметны через 32 часа после оплодотворения. С помощью покадровой конфокальной микроскопии мы анализируем морфогенез дуг глотки. В Smad пять слияний мутантов между второй и третьей дугами появляются первыми через 32 часа после оплодотворения.

Согласовано со статическим анализом. В то время как экспрессия PDGF у членов семейства позволяет предположить, что он может быть широко вовлечен в морфогенез дуги глотки, движение задних дуг представляется нормальным. У мутантов P-D-G-F-R-A именно морфогенез первой дуги глотки, по-видимому, специфически нарушен.

Эта процедура поддается другим широко используемым методам рыбок данио, таким как инъекция морфо или создание генетической мозаики. Покадровый анализ позволяет провести непосредственный анализ последствий этих манипуляций. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить покадровую визуализацию in vivo трансгенных эмбрионов рыбок данио, правильно обезболивая и монтируя образцы и устанавливая идеальные параметры для конфокальной микроскопии.