Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

Эта рукопись представляет технику применять или освободить силы на прикрепленных клеток или тканей с использованием однонаправленной растяжения.

Общая цель этой процедуры заключается в растяжении клеток рисунка на эластичной мембране из полидиметилсубоксана или PDMS. Это достигается за счет нанесения листа A-P-D-M-S с последующим нанесением микрорисунка на PDMS. Затем лист PDMS с микрорисунком устанавливается на растягивающее устройство, а сверху размещается средний подпорный бассейн.

Затем ячейки наносятся на поверхность листа PDMS с микрорисунком и позволяют им прикрепиться к рисунку перед промывкой для удаления неприкрепленных клеток. Последним шагом является нанесение удлинения на клетку, содержащую PDMS, чтобы растянуть клетки. В конечном счете, видеомикроскопия используется для того, чтобы показать, что приложение сил на ретракционные волокна митотических клеток млекопитающих при растяжении клетки приводит к деформации клетки.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомеханики, например, каково влияние внешних сил на клеточные процессы, такие как деление? Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели приложить усилия к делительной ячейке, чтобы начать вырезать кусок PDMS примерно 35 на 20 миллиметров из заранее изготовленного листа. Здесь используется коммерчески доступный тонкий лист PDMS, потому что он более воспроизводим и с меньшей вероятностью сломается по сравнению с изготовленным на заказ. ПДМС.

Снимите верхний и нижний защитные слои пластика и с помощью пинцета поместите PDMS в пластиковую чашку Петри. Затем промойте PDMS с 70%-ным этанолом в течение пяти минут на ротаторе со скоростью 30 колебаний в минуту. После промывки высушите поверхность, обдувая ее воздухом.

Далее подсвечивайте ПДМС глубоким ультрафиолетом в течение пяти минут на расстоянии от ультрафиолетовых ламп около пяти сантиметров. Тем временем приготовьте раствор E-D-C-N-H-S, как описано в текстовом протоколе. Раствор необходимо готовить непосредственно перед применением, потому что реакционная способность раствора снижается в течение нескольких часов.

Переложите листы PDMS из чашки Петри на крышку чашки Петри, которая не подсвечивалась. Это гарантирует, что окружение PDMS будет очень гидрофобным и способствующим. Следующий шаг.

Нанесите пипеткой раствор E-D-C-N-H-S на PDMS и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации. Смойте излишки E-D-C-N-H-S водой.

Далее добавьте привитый ПЭПЛ раствор ПЭГ и инкубируйте от трех часов до ночи при комнатной температуре после инкубации, промойте излишки привитого колышка ППЛЛ от ПДМС водой. В настоящее время PDMS пассивирован или функционализирован с помощью привитого PLL PEG и может храниться в течение нескольких дней при четырех градусах Цельсия. Для нанесения рисунка на место PDMS необходимо нанести лист A-P-D-M-S на синтетический кварцевый фотошаблон с микроэлементами для нанесения рисунка.

Поместите сторону PDMS, несущую привитый ПЭГ с ФАПЧ, лицом к хромированной стороне фотошаблона. Затем подсвечивайте в течение семи минут через фотошаблон на расстоянии от ультрафиолетовых лампочек около пяти сантиметров. Следующая подсветка.

Добавьте воду в маску и PDMS, затем медленно снимите PDMS с маски, закрепите ранее пассивированный PDMS на растягивающем устройстве. Прикрепите одну сторону PDMS к неподвижной части подрамника. Зафиксируйте другую сторону к подвижной части подрамника, не зажимая слишком сильно лист PDMS.

Если PDMS зажать слишком сильно, он становится короче, и это может привести к торможению, так как натяжение будет больше на ту же дистанцию растяжения. Убедитесь, что винты хорошо затянуты, иначе лист PDMS соскользнет, как только начнется растяжение, или позже во время эксперимента. Далее инкубируйте PDMS с раствором фибронектина в течение одного часа.

При комнатной температуре можно использовать другие белки внеклеточного матрикса, но они не были протестированы с помощью этого протокола. В качестве заключительного шага промойте PDMS фосфатно-соевым буфером. Затем вырежьте прямоугольник PDMS в толстой плите PDMS.

Затем вырежьте еще один прямоугольник внутри. Чтобы получить бассейн, который будет удерживать клетки и среду, добавьте силиконовую смазку под этот прямоугольный срез PDMS и поместите его поверх листа PDMS, чтобы создать средний удерживающий бассейн. Смазка позволит скользить бассейном по листу PDMS во время растяжения для моделирования ячеек.

Во-первых, отделите клетки от колбы с культурой при плавности 50%. Как только клетки окажутся во взвешенном состоянии, пипетируйте их несколько раз с помощью наконечника объемом 200 микролитров, чтобы разбить агрегаты, которые обеспечат связывание отдельных клеток с шаблоном. Далее добавьте в бассейн один миллилитр клеточной суспензии.

Дайте клеткам привязаться к узорам от 10 до 30 минут, в зависимости от клетки. Наберите инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию. После того, как клетки прикрепятся к узорам, аккуратно промойте плавающие клетки уравновешенной средой, чтобы промыть клетки.

Удалите среду с помощью аспирационной пипетки, одновременно добавляя среду. Крайне важно поддерживать достаточный поток для смывания неприкрепленных клеток, сохраняя при этом клетки погруженными в среду. Затем добавьте крышку на верхнюю часть бассейна, чтобы избежать испарения и утечки в случае поломки PDMS и позволить ячейкам распространиться в течение нескольких часов по шаблонам.

Затем поместите прибор на перевернутый микроскоп и приступайте к визуализации. Избегайте использования масляных иммерсионных объективов, так как они не будут работать из-за проблем с фокусировкой. Чтобы растянуть ячейки микрошаблона, поверните микрометрический винт, корректируя положение предметного столика по осям X, Y и Z.

Положение сцены необходимо скорректировать, чтобы противодействовать расширению PDMS и потере фокуса. Методика, представленная в этом видеопротоколе, позволила прикладывать усилия к втягивающим волокнам митотических клеток млекопитающих путем растяжения субстрата в начале метафазы. Некоторые из этих ретракционных волокон были оттянуты от тела клетки, в результате чего механическая сила была приложена к коре митотических клеток перед растяжением, для достижения этого клетка была покрыта овальной формой.

Нанесение рисунка осуществляется с растягиванием PDMS во время оттиска круглых узоров через фотомаску. После растяжения подложка растягивается таким образом, что узор приобретает форму круга. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как можно наносить пластины на макроузоры, а затем прикладывать растягивающие силы к подложке.