Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

Общая цель данной процедуры — растянуть клетки с заданным паттерном на эластичной мембране из полидиметилсилоксана (PDMS). Это достигается путем изготовления листа PDMS с последующим нанесением микропаттерна на PDMS. Затем лист PDMS с микропаттерном закрепляют на устройстве для растяжения, а сверху устанавливают резервуар для удержания среды.

Затем клетки высевают на поверхность микроструктурированного листа PDMS и оставляют для прикрепления к структуре, после чего проводят промывку для удаления неприкрепившихся клеток. Заключительным этапом является растяжение PDMS с клетками для деформации самих клеток. В конечном итоге используется видеомикроскопия, чтобы показать, что воздействие сил на ретракционные волокна митотических клеток млекопитающих при растяжении клеток приводит к деформации клетки.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомеханики, например, каковы эффекты воздействия внешних сил на такие клеточные процессы, как деление? Идея этого метода возникла у нас, когда мы захотели воздействовать силами на делящуюся клетку; для начала необходимо вырезать фрагмент PDMS размером примерно 35 на 20 миллиметров из заранее подготовленного листа. В данном случае используется коммерчески доступный тонкий лист PDMS, так как он обладает лучшей воспроизводимостью и меньшей склонностью к разрывам по сравнению с PDMS собственного изготовления.

Удалите верхний и нижний защитные пластиковые слои и с помощью пинцета поместите PDMS в пластиковую чашку Петри. Затем промойте PDMS 70% ethanol в течение пяти минут на ротаторе при 30 колебаниях в минуту. После промывки высушите поверхность, обдув ее потоком воздуха.

Затем облучайте PDMS глубоким ультрафиолетовым светом в течение пяти минут на расстоянии около пяти сантиметров от ультрафиолетовых ламп. Тем временем приготовьте раствор E-D-C-N-H-S согласно текстовому протоколу. Раствор необходимо готовить непосредственно перед использованием, так как его реакционная способность снижается в течение нескольких часов.

Перенесите листы PDMS из чашки Петри на крышку чашки Петри, которая не подвергалась облучению. Это обеспечит высокую гидрофобность поверхности вокруг PDMS и облегчит выполнение следующего этапа.

Пипеткой нанесите раствор E-D-C-N-H-S на PDMS и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации удалите излишки E-D-C-N-H-S, промыв поверхность водой.

Затем добавьте раствор ПЭГ-привитого ПЛЛ и инкубируйте от трех часов до ночи при комнатной температуре; после инкубации промойте ПДМС водой, чтобы удалить излишки ПЭГ-привитого ПЛЛ. Теперь ПДМС пассивирован или функционализирован ПЭГ-привитым ПЛЛ и может храниться в течение нескольких дней при температуре четыре градуса Цельсия. Для создания рисунка на ПДМС поместите лист ПДМС на фотошаблон из синтетического кварца с микроструктурами, необходимыми для формирования рисунка.

Поместите сторону PDMS с привитым ПЭГ-ПЛЛ лицевой стороной к хромированной стороне фотошаблона. Затем подвергните облучению в течение семи минут через фотошаблон на расстоянии около пяти сантиметров от ультрафиолетовых ламп. После облучения.

Добавьте воду на маску и PDMS, затем медленно отделите PDMS от маски. Закрепите предварительно пассивированный PDMS на устройстве для растяжения. Прикрепите одну сторону PDMS к неподвижной части растяжителя. Зафиксируйте другую сторону на подвижной части растяжителя, стараясь не зажимать слишком большую площадь листа PDMS.

Если PDMS зажат слишком сильно, он укорачивается, что может привести к разрыву, так как при той же величине растяжения натяжение будет выше. Убедитесь, что винты надежно затянуты, иначе лист PDMS может соскользнуть в начале растяжения или в ходе эксперимента. Затем инкубируйте PDMS в растворе фибронектина в течение одного часа.

При комнатной температуре можно использовать другие белки внеклеточного матрикса, однако они не были протестированы в рамках данного протокола. В качестве заключительного этапа промойте PDMS фосфатно-солевым буферным раствором. Затем вырежьте прямоугольник из толстой пластины PDMS.

Затем вырежьте внутри еще один прямоугольник. Чтобы создать резервуар, который будет удерживать клетки и среду, нанесите силиконовую смазку под этот вырезанный прямоугольный фрагмент PDMS и поместите его сверху на лист PDMS для создания резервуара для среды. Смазка позволит резервуару скользить по листу PDMS во время растяжения для формирования паттерна клеток.

Сначала отделите клетки от культурального флакона при 50% конфлюэнтности. Когда клетки окажутся в суспензии, несколько раз пропипетируйте их наконечником на 200 µL для разрушения агрегатов, что обеспечит связывание отдельных клеток с паттерном. Затем добавьте один миллилитр клеточной суспензии в лунку.

Дайте клеткам связаться с паттернами в течение 10–30 минут, в зависимости от типа клеток, в инкубаторе при 37 °C. После того как клетки прикрепятся к паттернам, осторожно промойте их уравновешенной средой, чтобы удалить несвязавшиеся клетки.

Удалите среду с помощью аспирационной пипетки, одновременно добавляя новую среду. Важно поддерживать достаточный поток, чтобы вымыть неприкрепившиеся клетки, при этом удерживая клетки погруженными в среду. Затем накройте поверхность покровным стеклом, чтобы предотвратить испарение и утечку среды в случае повреждения PDMS, и оставьте клетки на несколько часов для растекания по паттернам.

Затем поместите устройство на инвертированный микроскоп и приступите к визуализации. Избегайте использования объективов с масляным погружением, так как они не будут работать из-за проблем с фокусировкой. Чтобы растянуть клетки в микропаттерне, поворачивайте микрометрический винт, корректируя положение предметного столика по осям x, y и Z.

Положение предметного столика необходимо скорректировать, чтобы компенсировать расширение PDMS и потерю фокуса. Метод, представленный в данном видеопротоколе, позволил воздействовать силами на ретракционные волокна митотических клеток млекопитающих путем растяжения субстрата в начале метафазы. Некоторые из этих ретракционных волокон были оттянуты от тела клетки, что привело к возникновению механической силы, воздействующей на кортекс митотических клеток; для достижения этого эффекта клетка высевается на овальный паттерн.

Создание паттерна осуществляется путем растяжения PDMS во время оттиска круглых рисунков через фотошаблон. После растяжения подложку растягивают таким образом, чтобы паттерн стал округом. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как высаживать клетки на макропаттерны и затем прикладывать к подложке растягивающие усилия.