Мониторинг внутривидовой конкуренции в бактериальной популяции клеток путем кокултивации флуоресцентно маркированных штаммов

В этом методе используется совместное культивирование меченых флуоресцентно меченых bacillus sutilis для мониторинга быстрого клонального расширения и устранения полезных и вредных мутаций в популяции бактериальных клеток с течением времени. Во-первых, подготовьте предварительные культуры бактерий для соревновательного эксперимента. Смешайте равное количество штаммов с флуоресцентной меткой и совместно культивируйте бактерии в различных условиях питания.

Затем соберите образцы в разные моменты времени, разбавьте соответствующим образом и размножьте клетки на агаровых пластинах. Теперь визуализируйте и подсчитайте выжившие штаммы с помощью стереофлуоресцентной микроскопии. В конечном счете, результаты могут определить процент выживших бактерий по отношению ко всему количеству подсчитанных колоний.

В отличие от мониторинга внутривидовой конкуренции с использованием различных кассет с антибиотиками для мечения штаммов. В этом методе флуоресцентно меченые конкурирующие штаммы почти полностью изотонически и способны вариться на тех же планшетах AGA. Предварительная процедура будет представлена Лореной, которая является аспирантом в моей лаборатории, инокулирует четыре миллилитра среды LB одним микролитром бактерий от минус 80 градусов Цельсия, криозапасами, и вырастит предварительные культуры в течение ночи при 28 градусах Цельсия и 220 об/мин разведит 0,1 миллилитра культуры на 0,9 миллилитра среды LB в 1,5 миллилитре. и определить оптическую плотность.

Затем для получения смешанных клеточных популяций для конкурсных экспериментов инокулируют 100 миллилитровые колбы, содержащие 20 миллилитров CGLC и CGLC. Минимальную среду в соотношении один к одному, переложите 10 миллилитров культур в 15 миллилитровые пластиковые пробирки. Соберите клетки центрифугированием в течение 10 минут при 4000-кратном течении силы тяжести и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем ресуспендируют клетки в 0,5 миллилитрах свежей LB-среды, а клетки переложите в стерильную реакционную чашку объемом 1,5 мл, добавьте 0,5 мл 50%-ного стерильного глицерина. Перемешайте суспензию путем тщательного вортекса и храните образцы в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия. Далее культура, оставшиеся бактерии в колбах встряхивают.

Храните колбы в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание флоры, заставьте образец культуры на 0,1 миллилитра после семи часов и 24 часов измерения роста и обратите внимание на оптическую плотность от одного до 10 разведения образцов, сделайте криозапасы образцов для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. После сбора всех образцов разморозьте криозапасы и разведите клетки в 0,9%-ном солевом растворе для каждой штаммовой пластины. От 0,1 мл 10 до отрицательной пятой развести на агаровой пластине со средним содержанием SP и распределить клетки с помощью стерильной стеклянной пипетки.

Инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в темноте, пока не появятся отдельные колонии с черным пером. Разделите нижнюю часть агаровой пластины на четыре части для лучшей ориентации, подсчитывая выживших под стереофлуоресцентным микроскопом. Теперь поместите пластину вверх дном под микроскоп и сфокусируйте колонии с помощью холодного источника света.

Как только колонии окажутся в фокусе, переключитесь на соответствующий набор фильтров для CFP Flora four. Чтобы визуализировать выжившие клетки штамма, меченного CFP, подсчитайте выживших от этого штамма, пометив колонии ручкой. И обратите внимание на цифру.

Удалите этикетки с помощью этанола. Затем переключитесь на набор фильтров YFP. Визуализировать выжившие клетки штамма, меченного YFP.

Снова пересчитайте выживших, пометив колонии ручкой. И обратите внимание на цифру. Откройте снимки с одного места, которые были сделаны с помощью набора фильтров CFP и набора фильтров YFP.

Оптимизируйте контрастность и яркость, чтобы уменьшить флуоресценцию фона на носителях. Перейдите к одной из картинок и выберите все. Скопируйте изображение и вставьте его на другое изображение.

Объедините снимки, выбрав в меню слоев опцию более светлый цвет. В этом эксперименте популяция клеток, состоящая из двух штаммов ИМК, была помечена Fluor CFP и YFP для оценки влияния различных источников азота на рост путем нанесения соответствующего разведения на агаровые пластины. Клональный состав клеточной популяции с течением времени может быть точно определен простым подсчетом желтых и синих флуоресцентных колоний.

Активность фермента глутаматдегидрогеназы сильно влияет на приспособленность отуса в зависимости от наличия экзогенного глутамата. В отсутствие экзогенного глутамата высокий уровень активности GDH невыгоден для бактерий, так как ферменты Rock G и хороший B разрушают глутамат, который необходим для анаболизма. Напротив, синтез двух функциональных gdhs является выгодным для бактерий при наличии экзогенного глутамата, поскольку в дополнение к G-глюкозе глутамат используется в качестве источника углерода.

Аналогичные результаты были получены в эксперименте с переключением кристаллов. Опять же, бактерии, обладающие высоким уровнем активности GDH, были вытеснены клетками со сниженной активностью GDH в питательных средах, лишенных глутамата. Напротив, бактерии, синтезирующие только один активный GDH, были исключены из культуры.

Когда среда была дополнена глутаматом, очевидно, что первоначальный состав популяции смешанных клеток оставался почти неизменным с течением времени. Независимо от Fluor вместе взятых. Использование Flora Force является мощным инструментом для мониторинга внутривидовой конкуренции в популяции бактериальных клеток после того, как были созданы сильные стороны конкурентов.

Эту методику можно сделать за пять дней, если она выполнена правильно.