Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Общая цель следующих экспериментов заключается в эффективном получении миллиграммовых количеств белка Kinlin 3 в культуре клеток насекомых, что невозможно реализовать в других экспрессионных системах. Это достигается путем трансфекции вектора переноса KINLIN 3 совместно с модифицированным бакуловирусным вектором для создания рекомбинантного бакуловируса, несущего ген KINLIN 3. На втором этапе вирус амплифицируют в клетках насекомых для получения количества вирионов, достаточного для последующих этапов.

Затем клетки насекомых заражают для получения больших количеств белка Kinlin 3 с целью его последующей очистки методом быстрой жидкостной хроматографии. Полученные результаты, основанные на анализе методом SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографии, показывают, что функциональный белок kinlin 3 высокой степени чистоты может быть получен в миллиграммовых количествах. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как экспрессия kinlin 3 в бактериях, является то, что экспрессия в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом, увеличивает выход рекомбинантного белка в десять раз.

Клетки SF nine для данной процедуры культивируют и поддерживают в суспензии, используя среду SF 902 с добавлением 100 µg/mL пенициллина и 100 µg/mL стрептомицина. Для получения бакуловируса клетки следует культивировать до достижения плотности в диапазоне от 5×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл. Для подготовки клеток SF nine к трансфекции распределите примерно 1×10⁶ клеток на одну лунку стерильного 6-луночного планшета для культивирования тканей в 2 мл среды SF 902 с добавлением пенициллина и стрептомицина; выдержите клетки SF nine около 20 минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу для их прикрепления к дну пластиковых лунок с образованием монослоя. Генерация рекомбинантного бакуловируса осуществляется путем ко-трансфекции плазмидной ДНК и ДНК BMid в монослой культуры SF nine.

Экспрессионный вектор papine neuron firm T three содержит ген KINLIN three мыши firm T three. Он находится под контролем вирусного промотора P 10 BAO и обладает фланкирующими вирусными последовательностями bao для обеспечения рекомбинации с back mid, а также кодирует C-концевой гистидиновый тег hiss six для последующей очистки. Для каждой трансфекции смешивают 1–2 µg очищенного MFI T three с 0.5 µg очищенного B mid и 100 µL SF 902 SFM без антибиотиков. Это раствор А. В отдельной пробирке разводят 6 µL cell effect in two reagent в 100 µL SF 902 SFM без антибиотиков.

Для каждой реакции трансфекции можно подготовить общую смесь (мастер-микс), чтобы сократить объем манипуляций с жидкостями при необходимости проведения множества трансфекций. Это раствор B. Смешайте растворы A и B, используя примерно 200 мкл каждого на одну трансфекцию, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут для формирования липид-ДНК-комплексов. Через 20 минут разбавьте липид-ДНК-комплексы, добавив 800 мкл SF 902 SFM без антибиотиков на одну трансфекцию. Затем осторожно аспирируйте среду из монослоя клеток SF9 и аккуратно нанесите смесь раствора AB и среды на монослой SF9.

Инкубируйте трансфецированные клетки в увлажненном инкубаторе при 27 °C в течение ночи, чтобы создать влажную среду и предотвратить высыхание клеток. Поместите шестилуночный планшет в пластиковый контейнер с крышкой вместе с влажным бумажным полотенцем. На следующий день добавьте по 1 мл SF 900 в SFM без антибиотиков в каждую культуру монослоя и инкубируйте клетки при 27 °C еще в течение пяти дней.

Через пять дней соберите рекомбинантный вирус bao непосредственно из культуральной среды и перенесите его в чистую центрифужную пробирку. Удалите остатки клеток SF nine центрифугированием при 1000 Gs в течение пяти минут. При комнатной температуре перенесите вирус, находящийся в полученном супернатанте и обозначенный как P1, в чистую пробирку. Можно считать, что вирусное поколение P1 имеет ожидаемый титр вируса 1 × 10⁷ PFU/мл.

Хотя при необходимости можно провести анализ бляшек (SA), храните вирусный сток P1 при температуре четырех градусов Цельсия в темноте до использования. Клетки SF9, используемые для амплификации рекомбинантного вируса balo, должны находиться в суспензии с плотностью 1,4 × 10⁶ клеток на миллилитр, а культура должна занимать одну двадцатую часть общего объема колбы. Например, 50 миллилитров в колбе объемом два литра. Как правило, для оптимальной амплификации вируса vao и продукции белка клетки SF9 должны быть однородного размера и сферической формы.

Заразите культуру клеток SF nine вирусным стоком P one с множественностью заражения (MOI) 0,1, используя следующую формулу. Инкубируйте зараженную культуру насекомых P one при 27 °C с перемешиванием при 100 RPM в течение 72 часов. Через три дня соберите вирус, отделив клетки от среды путем центрифугирования при 1000 G в течение пяти минут.

При комнатной температуре перенесите осветленную среду, обогащенную вирусом, в чистую пробирку. Данный вирусный сток обозначается как P2; ожидаемый титр вируса составляет 2 × 10⁸ PFU/мл. Храните этот вирусный сток при температуре 4 °C в темноте до использования, а полученные осадки клеток храните при температуре −20 °C для последующего подтверждения продукции рекомбинантного вируса.

Для начала данной процедуры вырастите необходимый объем культур клеток SF nine в суспензии в среде SF 902 s fm, дополненной 100 µg/mL пенициллина и 100 µg/mL стрептомицина. Отношение общего объема культуры к объему колбы должно составлять 1:5.

Инкубируйте суспензионные культуры при 27 °C с перемешиванием при 100 RPM до достижения плотности клеток 2 × 10⁶ клеток/мл. Когда культуры Sf9 достигнут плотности 2 × 10⁶ клеток/мл, они будут готовы к заражению вирусом balo. Добавьте в культуры фетальную бычью сыворотку до конечной концентрации 1%, после чего внесите вирусный сток P2.

Для достижения MOI, равного одному, инкубируйте инфицированные культуры при 27 °C с перемешиванием при 100 RPM. Через 72 часа после инфицирования соберите клетки SF nine, экспрессирующие рекомбинантный Lin-3 с полигистидиновым тегом, путем центрифугирования при 1000 ×g в течение 20 минут при комнатной температуре. Храните полученный осадок клеток при -20 °C до использования или при -80 °C для длительного хранения. Данная процедура начинается с размораживания на льду.

Замороженные пеллеты клеток SF nine, инфицированных вирусом vao и экспрессирующих рекомбинантный кинлин-3, ресуспендируют в лизирующем буфере. После инкубации ресуспендированных клеток в лизирующем буфере в течение 5–10 минут образец перемешивают на вортексе до достижения гомогенности суспензии для дальнейшего разрушения клеток. Образец подвергают соникации в ледяной бане.

Осветлите лизат путем центрифугирования при 48 000 g в течение одного часа при температуре 4 °C. Нанесите полученный супернатант на колонку HisTrap объемом 5 мл, предварительно уравновешенную лизисным буфером при 4 °C, со скоростью 1 мл/мин. Последующие этапы элюции белка, обмена буфера и концентрирования белка здесь не демонстрируются, но подробно описаны в прилагаемой рукописи.

После получения белкового раствора с замененным буфером нанесите его на предварительно уравновешенную колонку HiTrap Heparin HP объемом 5 мл с использованием системы ACTA FPLC со скоростью 0,5 мл/мин. Связанный KINLIN 3 элюируют с помощью линейного градиента NaCl в том же буфере с шагом 10 мМ/мл. Ожидается, что KINLIN 3 элюируется при концентрации NaCl около 0,6 М. После концентрирования белка финальным этапом является замена буфера с помощью эксклюзионной хроматографии: нанесите очищенный белок на колонку Superdex 200 10/300 GL и проведите очистку белков по размеру, подавая буфер в колонку со скоростью 0,5 мл/мин.

Белок, вымываемый из колонки, фракционируют и мониторят с помощью абсорбции при 280 нанометрах. Успех генерации рекомбинантного вируса подтвердили, оценив наличие рекомбинантного Kinlin three в трансфецированных клетках SF nine с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга, что показано на этом репрезентативном вестерн-блоте шести маломасштабных культур SF nine с использованием антител к His6; после амплификации вируса и его использования для инфицирования клеток SF nine в крупномасштабных экспериментах в каждом образце была видна четкая полоса, соответствующая His-тегированному белку массой 75 килодальтон. Рекомбинантный KINLIN three частично очищали методом металло-аффинной хроматографии.

Основное изображение геля на этом рисунке демонстрирует SDS-ПАГЭ никель-аффинитивно очищенного рекомбинантного мышиного белка кинлина-3, экспрессированного в клетках SF nine, зараженных вирусом BAO; абсорбированный белок элюировали с использованием градиента имидазола, показанного над изображением геля. MW обозначает маркер молекулярной массы, LYS — лизат целых клеток, FT — проскок, WI — первая промывка и WII — вторая промывка. Также был проведен вестерн-блот-анализ фракций элюции для подтверждения наличия сконструированного His-тега на рекомбинантном белке.

Затем частично очищенный KINLIN 3 подвергали дальнейшей очистке почти до гомогенного состояния с помощью ионообменной хроматографии на гепариновой колонке. На данной панели представлен профиль элюции, зарегистрированный при 280 нм (синим цветом), с одним симметричным пиком, выходящим при линейном градиенте хлорида натрия (отмечено зеленым) в диапазоне концентраций от 0,05 M до 1,0 M. Нижняя панель демонстрирует результаты SDS-PAGE анализа фракций элюирования, подтверждающие наличие белка Kinlin 3 с массой 75 кДа.

В качестве заключительного этапа была проведена очистка KINLIN three методом эксклюзионной хроматографии для удаления агрегатов и достижения гомогенности. На данном репрезентативном профиле элюции при гель-фильтрации представлен очищенный Kinlin three, полученный с использованием колонки SUEx S 200 в буфере Tris HCL pH 7.5, содержащем 150 millimolar NaCl и 1 millimolar DTT, при температуре 20 °C. Исходя из объема элюции, KINLIN three мигрирует в соответствии с ожидаемыми показателями для белка массой 75 kilodalton, что указывает на его преимущественно мономерную форму.

На следующем рисунке представлены результаты электрофореза в ПААГ с SDS высококонцентрированного очищенного рекомбинантного кинлина-3, обозначенного как K3, в концентрации 14,5 mg/mL. Получение миллиграммовых количеств полноразмерного кинлина-3 мыши высокой степени очистки в культуре клеток насекомых позволит провести обширные структурные исследования и биохимический анализ белка. В данной работе также был проведен анализ термостабильности (thermo shift assay) с использованием прибора ThermoFluor для определения буферов, стабилизирующих KINLIN 3.

Белок KINLIN three разводили в различных буферах, создавая двумерную матрицу зависимости pH от концентрации хлорида натрия. На верхней панели представлена 3D-гистограмма температур перехода, а на нижней панели показано изменение температуры перехода относительно рассчитанного среднего значения 50.4 °C. Столбцы окрашены в соответствии с диапазоном температур, которым они соответствуют.

Было установлено, что KINLIN three сохраняет стабильность при высоких концентрациях хлорида натрия в диапазоне pH от 7,0 до 9,0 с постоянной температурой плавления 55 °C. Также было отмечено, что в диапазоне pH от 7,0 до 7,5 температура плавления Kinlin three составляла приблизительно 55 °C независимо от концентрации хлорида натрия.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получать высокочистый функциональный рекомбинантный киндлинг для детальной биофизической характеристики и дальнейших исследований. Аналогичные подходы могут быть использованы с другими трудноподготовляемыми образцами белков, и мы рекомендуем применять данный метод в таких случаях.