Антиядерные антитела скрининг Использование клеток Нер-2

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании метода непрямой иммунофлуоресценции для скрининга антинуклеарных антител. Это достигается путем инкубации сыворотки пациента со стеклами-субстратами, содержащими клетки HEp-2. Несвязанная сыворотка пациента вымывается, после чего связанные аутоантитела инкубируют со специфическим конъюгатом, меченным флуоресцеином, а затем вымывают несвязавшийся реагент.

При рассмотрении под флуоресцентным микроскопом образцы, положительные по аутоантителам, будут демонстрировать яблочно-зеленую флуоресценцию в областях клетки или ядер, где связались аутоантитела, создавая характерный рисунок флуоресценции, указывающий на наличие соответствующего антигена. В конечном итоге выявление ANA может быть использовано для помощи в диагностике заболеваний соединительной ткани. Основным преимуществом метода непрямой иммунофлуоресценции перед другими методами, такими как твердофазный ELISA, является то, что субстрат из клеток Hep-2 содержит более 100 антигенов, экспрессированных в их нативной конфигурации.

Это позволяет идентифицировать почти все клинически значимые антитела группы O, что невозможно при использовании методов с твердой фазой, так как метод непрямой иммунофлуоресценции является узкоспециализированным. Специалистам, ранее не применявшим данный метод, требуется время и практика для освоения процедуры обработки предметных стекол. Интерпретация микроскопических изображений и умение распознавать соответствующие паттерны также являются навыками, требующими времени для совершенствования.

При использовании подходящих реагентов и инструментов результаты становятся более воспроизводимыми и более простыми для интерпретации. Процедуру продемонстрирует Кассандра Брайант, технолог Лаборатории по разработке иммунофлуоресцентного анализа. Извлеките реагенты из упаковки и дайте каждому компоненту достичь комнатной температуры; подготовьте реагенты и разведите сыворотку пациента в соответствии с инструкцией-вкладышем. Слайды имеют штрихкоды, что позволяет легко интегрировать их в автоматизированные системы.

В данной процедуре показана ручная обработка предметных стекол. Однако лаборатории с высокой пропускной способностью могут использовать автоматизированное оборудование для обработки стекол с функцией сканирования штрихкодов. Инструменты Inova подключены через централизованную интеллектуальную сеть, которая обеспечивает контроль за ходом рабочего процесса, результатами и отчетностью.

Для проведения МИФ. Это обеспечивает достоверную идентификацию пациентов в процессе обработки и позволяет исключить ошибки транскрипции и иные сопутствующие ошибки. Нанесите одну каплю положительного контроля и одну каплю отрицательного контроля на соответствующий предметное стекло.

В остальные лунки пипеткой вносят от 20 до 25 µL разведенной сыворотки пациента. Обрабатывайте каждое стекло по отдельности. Поместите стекло в контейнер для окрашивания, на дно которого положено влажное бумажное полотенце, закройте контейнер и инкубируйте стекло в течение 30 минут.

Влажные условия предотвратят высыхание субстрата, что могло бы привести к появлению артефактов окрашивания. В течение этого периода инкубации антинуклеарные антитела в сыворотке пациента будут связываться с антигенами клеток, фиксированных в каждой лунке. По истечении периода инкубации осторожно смойте сыворотку тонкой струей промывочного буфера, чтобы не повредить субстрат.

Слегка наклоните предметное стекло так, чтобы поток жидкости не был направлен непосредственно на субстрат. Такое расположение стекол также поможет предотвратить перекрестное загрязнение образцов между лунками. Удалите излишки промывочного буфера путем легкого постукивания и поместите предметное стекло в контейнер Копленда с промывочным буфером.

Время инкубации на этапе промывки должно составлять примерно пять минут. Извлеките предметные стекла из промывочного буфера и осторожно встряхните их. Для удаления излишков промывочного буфера нанесите одну каплю флуоресцентного конъюгата в каждую лунку.

Для тестирования на NA рекомендуется использовать конъюгат, специфичный к Fc-фрагменту IgG. Инкубируйте предметные стекла в течение 30 минут в увлажненном контейнере, обязательно заменив крышку для окрашивания. Конъюгат чувствителен к свету, и крышка защитит стекла от светового воздействия.

В течение этого периода инкубации конъюгат связывается с антинуклеарными антителами пациента, которые, в свою очередь, связались с клеточными антигенами. Связывание конъюгата приводит к возникновению флуоресценции в лунках после инкубации. Промойте предметное стекло промывочным буфером.

Как и прежде, положите покровное стекло на бумажное полотенце и нанесите среду для заключения непрерывной линией на нижний край покровного стекла. Извлеките каждый предметный слайд из промывочного буфера и осторожно постучите по нему. Чтобы удалить излишки промывочного буфера, прикоснитесь нижним краем слайда к краю покровного стекла.

Осторожно опустите предметное стекло на покровное стекло таким образом, чтобы заключающая среда на покровном стекле растеклась до верхнего края предметного стекла без образования пузырьков воздуха; подбор оптимального количества заключающей среды — это навык, требующий практики для достижения идеального результата. Поместите стекла в флуоресцентный микроскоп, расположенный в темной комнате; сканирование всей лунки следует проводить с использованием объектива 20 x или 25 x. Для оценки распределения клеток и равномерности флуоресценции переключитесь на объектив 40 x.

Для окончательной интерпретации результатов на предмет позитивности и характера окрашивания обратите внимание на положительный и отрицательный контроли. Отрицательный контроль может быть не полностью темным, но часто демонстрирует низкий уровень неспецифической флуоресценции. В положительном контроле в ядре будет наблюдаться яркая ярко-зеленая флуоресценция.

Степень положительной реакции можно оценить по шкале реактивности от 1+ до 4+. Помимо ручной интерпретации, предметные стекла могут быть загружены и просканированы с помощью автоматического флуоресцентного микроскопа. Использование темной комнаты не требуется.

После создания проекта с выбором соответствующего типа слайда прибор захватывает и сохраняет цифровые изображения клеток в каждой лунке с высоким разрешением. Кроме того, система Nova view измеряет интенсивность флуоресцентного излучения, классифицирует результаты как положительные или отрицательные и обеспечивает распознавание паттернов для положительных образцов. Оператор просматривает изображения на компьютерном мониторе с высоким разрешением, что позволяет провести окончательную интерпретацию, корректировку и подтверждение данных Nova View.

Отчеты о результатах могут быть сформированы на основании подтвержденных данных. Связывание аутоантител с составляющими белковыми структурами ядра приводит к возникновению пяти основных ядерных паттернов, включая гомогенный, speckled (крапчатый), центромерный, ядрышковый и точечный ядерный паттерны. Чтобы определить гомогенный паттерн, как показано здесь, найдите митотические или делящиеся клетки.

Клетки в состоянии митоза демонстрируют сплошную однородную флуоресценцию, которая зачастую выражена сильнее, чем в клетках в состоянии покоя. Ядра клеток в состоянии покоя должны быть однородными с диффузным окрашиванием. Эта характерная картина, скорее всего, является результатом воздействия аутоантител к двухцепочечной ДНК.

Ключевой характеристикой крапчатого паттерна является вид метафазных митотических клеток, напоминающий монетную прорезь. Хромосомная область этих клеток отрицательна. В покоящихся клетках крапчатый паттерн наблюдается по всему объему ядер.

Спекл-паттерн (крапчатое свечение) может быть определен как грубый или мелкий. Грубодисперсное свечение является результатом наличия аутоантител к SM и RNP. Мелкодисперсное свечение может быть обусловлено аутоантителами к S-S-A-S-S-B, а также к РНК-полимеразе.

Паттерн DFS характеризуется как плотномелкосетчатый и указывает на наличие аутоантител к DFS 70. В митотических клетках наблюдается сетчатое окрашивание, в то время как в покоящихся клетках мелкие вкрапления равномерно распределены по всему ядру. В таких случаях следует провести подтверждающие тесты, поскольку аутоантитела к DFS 70 часто встречаются у здоровых людей по сравнению с пациентами с заболеваниями соединительной ткани.

Для определения паттерна центромер просканируйте лунки и выявите клетки в состоянии митоза или деления. Делящиеся клетки характеризуются наличием многочисленных отдельных крапинок, расположенных в тесном соседстве друг с другом, что часто называют метафазной пластинкой. В клетках покоя наблюдается примерно от 40 до 60 отдельных крапинок, распределенных по всему ядру.

Центромерный паттерн ассоциируется с аутоантителами к центромерным белкам, так же как и ядрышковый паттерн. Окрашивание хромосомных областей в клетках в стадии митоза варьирует. Ядрышковый паттерн сопровождается гомогенным или мелкодисперсным окрашиванием ядер, а также слабым, мелкодисперсным или гомогенным окрашиванием нуклеоплазмы ядер клеток в состоянии покоя.

Данный паттерн ассоциирован с аутоантителами к РНК-полимеразе III, фибриллину и антителам к PM-Scl. Точечный ядерный паттерн характеризуется отсутствием свечения в метафазных и митотических клетках и наличием нескольких отдельных точек в ядрах покоящихся клеток. Этот характерный паттерн часто является результатом воздействия аутоантител к SP 100, PML или P 80 colan.

Эти антитела связаны с первичным билиарным циррозом и аутоиммунным гепатитом. На представленном изображении точечный ядерный паттерн демонстрирует цитоплазматическое окрашивание, вызванное аутоантителами к митохондриальным антигенам. Обнаружение антинуклеарных антител и распознавание паттерна служат важным инструментом для помощи в диагностике пациентов.

Понимание значения различных паттернов позволяет клиницистам и сотрудникам лабораторий проводить соответствующие последующие исследования. Наиболее важными факторами для правильной идентификации паттернов антинуклеарных антител являются выбор высококачественного клеточного субстрата и обработка предметных стекол с применением последовательной и качественной техники. Анализ стекол традиционно проводится с помощью флуоресцентной микроскопии в темных комнатах и выполняется квалифицированными технологами, знакомыми с различными паттернами в контексте клеточного цикла и морфологии клеток.

За последние несколько лет были разработаны системы цифровой визуализации для автоматизированного считывания предметных стекол; такие инструменты автоматизируют рабочий процесс, а также повышают согласованность считывания и интерпретации. Кроме того, использование предметных стекол со штрих-кодами обеспечивает прослеживаемость образцов на протяжении всего процесса, что исключает возможные ошибки транскрипции и повышает целостность данных и безопасность пациентов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выполнять каждый этап процедуры непрямой иммунофлуоресценции и как идентифицировать клинически значимые паттерны антинуклеарных антител.