Антиядерные антитела скрининг Использование клеток Нер-2

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании непрямого иммунофлуоресцентного анализа для скрининга антинуклеарных антител. Это достигается путем инкубации сыворотки крови пациента с двумя предметными стеклами hep. Несвязанная сыворотка пациента смывается, связанные аутоантитела затем инкубируются со специфическим конъюгатом, меченным флуоресцеином, и несвязанный реагент смывается.

При рассмотрении через флуоресцентный микроскоп положительные образцы аутоантител будут демонстрировать яблочно-зеленую флуоресценцию, соответствующую областям клетки или ядер, где аутоантитела связались в паттерне флуоресценции, указывающем на присутствие антигена. В конечном счете, наличие арнк может быть использовано для помощи в диагностике заболеваний соединительной ткани. Основное преимущество метода непрямой иммунофлуоресценции перед другими методами, такими как твердофазный метод Элизы, заключается в том, что субстрат двухклеточного гепатита содержит более 100 антигенов, экспрессированных в их нативной конфигурации.

Это позволяет идентифицировать почти все клинически значимые антитела к О, что невозможно при использовании методов сплошного лица, поскольку метод непрямой иммунофлюоресценции является очень специализированным методом. Новичкам в этом методе требуется время и практика, чтобы овладеть процедурой обработки предметных стекол. Интерпретация изображений с микроскопа и умение выявлять соответствующие закономерности также является навыком, для освоения которого требуется время.

При использовании правильных реагентов и инструментов результаты получаются более стабильными и их легче интерпретировать. Демонстрировать процедуру будет Кассандра Брайант, технолог из Лаборатории разработки иммунофлуоресцентного асэйта. Извлеките реагенты из упаковки и дайте каждому элементу нагреться до комнатной температуры, подготовьте реагенты и разведите сыворотку пациента в соответствии с направлением, вкладыши слайдов имеют штрих-код и могут быть легко интегрированы в автоматизированные системы.

Эта процедура иллюстрирует ручную обработку слайдов. Тем не менее, лаборатории с высокой производительностью могут выбрать оборудование для автоматизированной обработки слайдов с возможностью сканирования штрихкодов. Приборы Inova связаны между собой через централизованную интеллектуальную сеть, которая обеспечивает контроль над результатами рабочего процесса и отчетностью.

Для IFA. Это приводит к положительной идентификации пациента в результате обработки и устранения транскрипции и связанных с ней ошибок. Нанесите одну каплю положительного контроля и одну каплю отрицательного контроля на соответствующее предметное стекло.

В Лунки пипеткой вводят от 20 до 25 микролитров разведенной сыворотки пациента в оставшиеся лунки. Обрабатывайте по одному слайду за раз. Поместите предметное стекло в емкость для окрашивания с влажным бумажным полотенцем на дно, накройте контейнер крышкой и выдержите предметное стекло в течение 30 минут.

Влажные условия препятствуют высыханию субстрата, что может привести к образованию артефактных пятен. В течение этого инкубационного периода антинуклеарные антитела в сыворотке крови пациента будут связываться с антигенами клеток, которые закреплены на каждой лунке. После инкубационного периода смойте сыворотку с помощью мягкой струи буфера для промывки, чтобы не повредить субстрат.

Слегка наклоните предметное стекло так, чтобы струя не была прямо направлена на подложку. Такая ориентация слайдеров также поможет предотвратить пересечение проб между скважинами. Отстегните излишки буфера для стирки и поместите предметное стекло в банку Copeland, содержащую буфер для стирки.

Время инкубации для этапа промывки должно составлять примерно пять минут. Извлеките предметные стекла из буфера для стирки и осторожно постукивайте. Чтобы удалить излишки буфера для промывки, нанесите по одной капле флуоресцентного конъюгата на каждую лунку.

Для тестирования на НК рекомендуется использовать конъюгат, специфичный для IgG FC. Выдержите предметные стекла в течение 30 минут во увлажненной емкости и обязательно замените крышку для окрашивания. Конъюгат светочувствителен, а крышка защитит предметные стекла от воздействия света.

В течение этого инкубационного периода конъюгат будет связываться с антинуклеарными антителами пациента, которые связались с клеточными антигенами. Это связывание конъюгата приводит к присутствию флуоресценции в лунках после инкубации. Промойте предметное стекло с помощью буфера для промывки.

Как и раньше, положите чехловый лист на бумажное полотенце и нанесите монтажный материал непрерывной линией на нижний край покровного стекла. Извлеките каждое предметное стекло из буфера для промывки и осторожно постучите по предметному стеклу. Чтобы удалить излишки буфера стирки, прикоснитесь нижним краем ползуна к краю защитного стекла.

Аккуратно опустите ползунок на защитное стекло таким образом, чтобы монтажная среда на защитном стекле стекала к верхнему краю стекла без соскальзывания пузырьков воздуха, включая оптимальное количество монтажного материала - это техника, которая требует практики для идеального просмотра. При съемке предметных стекол с флуоресцентным микроскопом в темном помещении, сканирование всей лунки должно быть выполнено объективом 20 или 25 раз. Для оценки распределения клеток и равномерности флуоресценции переключитесь на объектив 40-кратного увеличения.

Чтобы сделать окончательную интерпретацию относительно позитивности и паттерна, рассмотрим позитивный и негативный контроль. Отрицательный контроль может казаться не полностью темным, но часто будет демонстрировать низкий уровень неспецифической флуоресценции. Положительный контроль будет отображать яркую яблочно-зеленую флуоресценцию в ядре.

Позитивность можно оценить по шкале оценки реактивности от одного плюс до четырех плюсов. В дополнение к ручной интерпретации, слайды могут быть загружены и отсканированы автоматическим флуоресцентным микроскопом. Темная комната не требуется.

После создания проекта путем выбора соответствующего типа предметного стекла прибор получает и сохраняет цифровые изображения ячеек с высоким разрешением в каждой скважине. Кроме того, Nova view измеряет интенсивность флуоресцентного света и классифицирует результаты как положительные или отрицательные, а также обеспечивает распознавание образов для положительных образцов. Изображения просматриваются оператором на компьютерном мониторе с высоким разрешением, что позволяет окончательно интерпретировать, редактировать и подтверждать Nova View.

Отчеты о результатах могут быть сгенерированы на основе подтвержденных результатов. Связывание аутоантител с составляющими белковыми структурами в ядре приводит к образованию пяти основных ядерных структур, включая гомогенную, крапчатую центромеру, нуклеолярную и ядерную точку. Чтобы определить однородную картину, как показано здесь, определите митотические или делящиеся клетки.

Митотические клетки демонстрируют твердую равномерную флуоресценцию, которая часто более выражена, чем в покоящихся клетках. Ядра покоящихся клеток должны быть однородными с диффузным окрашиванием. Этот характерный рисунок, скорее всего, является результатом аутоантител к двухцепочечной ДНК.

Ключевой характеристикой крапчатого узора является появление монетных щелей метафазных митотических клеток. Хромосомная область этих клеток отрицательная. Покоящиеся клетки демонстрируют пятнистый узор по всему ядру.

Пятнышки могут быть определены как грубые или мелкие. Курсовая крапинистость является результатом появления аутоантител к SM и RNP. Мелкое пятнышко может быть вызвано аутоантителами к S-S-A-S-S-B, а также РНК-полимеразе.

Рисунок DFS называется плотным, мелкокрапчатым и указывает на наличие аутоантител к DFS 70. Митотические клетки демонстрируют крапчатое окрашивание, в то время как клетки покоя демонстрируют равномерно распределенные мелкие пятнышки по всему ядру. В этих случаях следует провести подтверждающие тесты, поскольку аутоантитела DFS 70 преобладают у здоровых людей по сравнению с пациентами с заболеванием соединительной ткани.

Чтобы определить центромерный рисунок, просканируйте лунки и определите митотические или делящиеся клетки. Делящиеся клетки имеют многочисленные дискретные крапинки, тесно связанные друг с другом, часто называемые метафазным баром. Покоящиеся клетки показывают примерно от 40 до 60 дискретных пятнышек, распределенных по всему ядру.

Центромерный рисунок связан с аутоантителами к центромерным белкам с ядрышковым типом. Окрашивание хромосомной области в митотических клетках вариабельно. Ядрышковый рисунок связан с однородным или крапчатым окрашиванием ядер, а также слабым, крапчатым или однородным окрашиванием нуклеоплазмы ядер покоящихся клеток.

Этот паттерн связан с аутоантителами к РНК-полимеразе, трем фибриллину и антителам PM SCL. Ядерный точечный рисунок связан с отрицательной метафазой, митотическими клетками и небольшим количеством дискретных точек в ядрах покоящихся клеток. Этот характерный паттерн часто является результатом аутоантител к SP 100 PML или P 80 колан.

Эти антитела связаны с первичным билиарным циррозом печени и аутоиммунным гепатитом. На показанном изображении ядерный точечный рисунок демонстрирует цитоплазматическое окрашивание из-за аутоантител к митохондриальным антигенам. Обнаружение антинуклеарных антител и распознавание образов служит важным инструментом для помощи в диагностике пациента.

Понимание значимости различных закономерностей позволяет клиницистам и персоналу лабораторий проводить соответствующее последующее тестирование. Наиболее важными факторами для правильной идентификации паттернов антинуклеарных антител являются выбор высококачественного клеточного субстрата и обработка слайдов с использованием стабильно хорошей техники. Чтение слайдов традиционно выполняется с помощью флуоресцентной микроскопии в темных помещениях и проводится обученными технологами, которые знакомы с различными паттернами в контексте клеточного цикла и морфологии клеток.

В последние несколько лет были разработаны цифровые системы обработки изображений для автоматизированного считывания слайдов, такие инструменты автоматизировали рабочий процесс и повысили согласованность чтения и интерпретации. Кроме того, благодаря использованию предметных стекол со штрихкодами прослеживаемость образцов на протяжении всего процесса исключает потенциальные ошибки транскрипции и повышает целостность данных и безопасность пациентов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять каждый этап непрямой иммунофлюоресцентной процедуры и как определить клинически значимые паттерны антинуклеарных антител.