Измерение изменений в тактильной чувствительности в задней лапы мышей с использованием устройства Электронные фон Фрея
19 декабря 2013 г.
Электронные измерения фон Фрея являются эффективной и улучшенной альтернативой классическим нитям фон Фрея, поскольку они позволяют быстро и точно измерять изменения механических порогов отхода грызунов, реагирующих на непрерывно применяемые раздражители до и после воспалительного события.
Общая цель данной процедуры — измерить отсутствие ответов на механическое давление задней лапы мышей. Для этого животных сначала помещают на сетчатый пол и дают им привыкнуть к условиям. К нижней части задней лапы прикладывают полипропиленовый наконечник, постепенно увеличивая давление.
При возникновении соответствующей поведенческой реакции стимул удаляют. После сбора базовых значений животным проводят экспериментальное вмешательство перед дальнейшим тестированием. В конечном итоге сравнивают изменения порогов отдергивания задней лапы в разных группах лечения, чтобы определить влияние конкретной терапии на изменение тактильной чувствительности к давлению.
Боль является основным компонентом воспаления. Важно измерять и характеризовать боль в различных контекстах. Этот относительно простой метод оценки боли может быть применен ко многим различным моделям воспаления.
Процедуру продемонстрируют Тиана, исследователь-техник в моей лаборатории, Мэдисон Мак, которая участвовала в этой работе в качестве студента бакалавриата, и Акила Сайкс, в настоящее время являющаяся студенткой бакалавриата в моей лаборатории. Мы начнем с подготовки тестовой установки для обеспечения легкого доступа к задним лапам.
Поместите отдельные камеры на сетчатое дно. Сетчатое дно должно находиться на удобной высоте и опираться на устойчивую поверхность. Затем установите электронный аппарат фон Фрея на лабораторный стол.
Убедитесь, что датчик и кабель надлежащим образом подключены к дисплею, и включите прибор в режиме настройки. Установите показания на ноль и осторожно поместите прилагаемый контрольный груз на конус датчика Фон Фрея. Запишите показания и повторите эту процедуру в конце тестирования; если между двумя значениями обнаружится расхождение, аппарат может потребовать повторной калибровки.
Выберите полипропиленовый наконечник подходящего размера для исследуемой ткани. Жесткие наконечники хорошо подходят для менее чувствительных, более плотных тканей задней лапы. Осторожно установите наконечник на конус зонда.
Затем переключитесь из режима настройки в режим работы. В этом режиме будет отображаться максимальное приложенное давление при отведении зонда. Для измерения порогов отдергивания задней лапы требуются два исследователя.
Один специалист должен управлять аппаратом и проводить измерения, а другой — фиксировать эти результаты, чтобы минимизировать систематическую ошибку. Исследователь, работающий с анестезитером, не должен знать о назначенных вариантах лечения, а также о зафиксированных значениях порога отмены. Кроме того, для обеспечения согласованности измерений все исходные значения и значения порога отмены должен фиксировать один и тот же человек.
За 48 часов до начала лечения проводятся первые базовые измерения. Поместите абсорбирующий материал под подставку для сбора экскрементов. После установки наконечника и обнуления датчика исследователь, производящий измерения, должен поместить мышей в индивидуальные камеры.
Накройте камеры перфорированными крышками и поместите сверху тяжелый предмет. Чтобы предотвратить побег мышей, дайте им акклиматизироваться в камере в течение 15 минут перед началом процедуры. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями при постепенном увеличении давления и обеспечении внутренней согласованности собственных измерений, поэтому для получения воспроизводимых результатов необходима практика.
Когда будете готовы, медленно поднимите зонд обеими руками и стимулируйте подушечку левой или правой задней лапы. Постепенно увеличивайте давление до появления ноцицептивного поведения. Последнее определяется по отдергиванию задней лапы, облизыванию задней лапы или прыжкам с лапы.
Попросите другого исследователя зафиксировать значение давления, которое вызвало наблюдаемую поведенческую реакцию. Во время измерения полезно побудить мышь оставаться неподвижной, поместив кормовой pellet непосредственно за пределами камеры или издав легкий звук, например, осторожно постучав, непосредственно перед началом измерения. Повторяйте процедуру для каждой мыши, пока все животные не будут протестированы один раз, а затем повторите весь цикл еще четыре раза.
После сбора пяти исходных значений вычислите среднее значение для каждой мыши. Повторите измерения исходных показателей через 24 часа и используйте эти данные для расчета еще одного среднего значения. Чтобы убедиться в однородности исходных реакций у всех мышей, исключите животных, у которых средний исходный порог отдергивания составляет менее 3.5 грамм или если разница между исходными порогами составляет два грамма и более.
Наконец, распределите мышей по отдельным группам лечения таким образом, чтобы средний базовый порог отдергивания в каждой из них был максимально схожим. В данном случае пороги отдергивания измеряли после введения яда в заднюю лапу, ROS raca. Мыши контрольной группы, получавшие физиологический раствор, практически не продемонстрировали изменений по сравнению с базовым уровнем на всех этапах.
Ноцицептивные реакции в точках тестирования у обработанных мышей отчетливо сохранялись в течение шести часов. Кроме того, отек тканей, характерный для воспаления, наблюдался в задних лапах, обработанных ядом, но не в лапах, обработанных физиологическим раствором. Изменения тактильной чувствительности, вызванные действием яда, сопровождались притоком нейтрофилов, увеличившимся почти в 1000 раз.
По сравнению с задними лапами, обработанными физиологическим раствором, мастоциты подошвенной части тканей задней лапы в группе контроля были в основном сохранны или проявляли признаки легкой дегрануляции. Напротив, в группе спаривания в задних лапах наблюдалась умеренная и выраженная дегрануляция мастоцитов в 15–20% случаев. Данный метод может быть адаптирован для оценки механической или тактильной чувствительности в широком спектре тканей, помимо тканей задней лапы.
Таким образом, данный метод может быть внедрен во многие различные модели воспаления и боли у грызунов.
Обзор
В данной статье представлен метод измерения ноцицептивных реакций на механическое давление задней лапы мышей с использованием электронного прибора фон Фрея. Эта методика позволяет быстро и точно оценить изменения порогов механического отдергивания до и после проведения противовоспалительных вмешательств.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая оценка
- Модели воспаления
Теоретическая часть
- Измерение боли имеет решающее значение для понимания механизмов воспаления.
- Электронный аппарат фон Фрея обладает преимуществами перед классическими методами.
- Точное измерение порогов отдергивания необходимо для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Данный метод может быть адаптирован для различных моделей грызунов.
Цель исследования
- Оценка механической чувствительности в ответ на стимулы давления.
- Оценка влияния терапии на ноцицептивное поведение.
- Разработка надежного метода оценки боли для использования в исследованиях.
Используемые методы
- Привыкание мышей к сетчатому полу.
- Постепенное приложение давления с помощью полипропиленového наконечника.
- Регистрация порогов отдергивания двумя независимыми исследователями, не знающими о распределении групп.
- Сравнение исходных показателей и измерений после лечения.
Основные результаты
- После лечения наблюдались значительные изменения порогов отклика при отдергивании.
- Воспаление характеризовалось отеком тканей и притоком нейтрофилов.
- Дегрануляция тучных клеток различалась между группами лечения.
- Метод продемонстрировал применимость для различных типов тканей.
Выводы
- Электронный метод фон Фрея эффективен для оценки боли у грызунов.
- Данная методика позволяет углубить понимание механизмов воспалительной боли.
- Она закладывает основу для будущих исследований боли и эффективности лечения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оценка изменений тактильной чувствительности на моделях грызунов предоставляет критически важные данные на ранних этапах для валидации мишеней анальгетиков и снижения механистических рисков при разработке терапевтических средств для лечения боли. Метод электронного вон Фрея позволяет проводить быстрое количественное измерение порогов отдергивания при механическом воздействии, что обеспечивает воспроизводимую доклиническую оценку моделей воспалительной и нейропатической боли. Данный подход повышает прогностическую уверенность в воздействии на мишень и эффективности лечения перед переходом соединений к исследованиям на более поздних стадиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся ноцицептивных путей и механизмов модуляции боли.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков, обеспечивая количественные, внутренне контролируемые показатели тактильной чувствительности в различных группах лечения.
- Прогностическая ценность: облегчает сортировку портфеля препаратов посредством объективного сравнения исходных и пост-интервенционных порогов отдергивания для оценки модуляции мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления стандартизированных базовых показателей тактильной чувствительности.
- Воспроизводимость: Обеспечение стабильности при повторных измерениях в течение коротких промежутков времени, что способствует стандартизации анализа и сопоставимости данных между группами.
- Масштабируемость: Возможность проведения многократных измерений для одного субъекта, что повышает пропускную способность и надежность кампаний по скринингу соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует вызванную воспалением механическую аллодинию, что соответствует клиническим фенотипам боли при воспалительных и нейропатических состояниях.
- Трансляционная преемственность: Связывает этапы фундаментальных открытий и доклинических исследований, обеспечивая получение механистически значимых и количественно измеримых результатов чувствительности к боли.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего продолжения исследований (go/no-go) на основе воспроизводимых изменений порогов отдергивания после экспериментальных вмешательств.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод электронного вольфрамового волокна фон Фрея вписывается в континуум исследований — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до тестирования преклинической эффективности, в частности, для соединений, модулирующих болевой синдром.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем измерения ноцицептивных реакций на механическое давление как функционального показателя взаимодействия с мишенью.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты, готовые к анализу, которые необходимы для надежной оценки соединений в моделях боли.
- Аналитика: обеспечивает точное измерение порога отдергивания и статистическую сопоставимость данных между исходным состоянием и условиями лечения.
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической валидацией через показатели механической чувствительности, релевантные для конкретных заболеваний в моделях воспаления.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовая платформа для различных моделей воспалительной и нейропатической боли, сокращая необходимость в повторной разработке методов анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в модуляции путей передачи болевых сигналов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые измерения тактильной чувствительности с минимальной технической вариабельностью.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), что увеличивает эффективность использования капитала и снижает процент неудач на поздних стадиях из-за отсутствия мишенно-опосредованной эффективности.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию соединений на основе анализа рисков, исходя из количественных показателей изменения порогов механического отдергивания.
Особенности реализации
- Требуется обучение методам поведенческого наблюдения и идентификации ноцицептивных реакций для обеспечения согласованности измерений.
- Метод зависит от использования откалиброванного электронного аппарата фон Фрея и правильного подбора полипропиленовых наконечников для тканей задней лапы.
- Необходимо «ослепление» операторов и лиц, регистрирующих данные, относительно условий лечения для минимизации систематической ошибки при записи пороговых значений.
- Предусматриваются критерии исключения на основе вариабельности базового порога для обеспечения гомогенности групп и целостности данных.
- Ограничено измеряемыми поведенческими реакциями; требуются четкие ноцицептивные конечные точки, такие как отдергивание лапы, вылизывание или прыжки.
