Цитотоксическая Эффективность фотодинамической терапии в клетках остеосаркомы

Общая цель данного эксперимента — показать цитотоксическую эффективность фотодинамической терапии в клетках остеосаркомы. Это достигается путем измерения внутриклеточного поглощения фотосенсибилизатора M-T-H-P-C клетками остеосаркомы. На втором этапе лазерный свет подается на клетки для активации M-T-H-P-C и производства цитотоксических радикалов кислорода.

Наконец, клеточный метаболизм и количество клеток измеряются с помощью водорастворимого теста Tetra oleum one или WST One. В конечном счете, анализ WST one, а также прямой подсчет клеток могут быть использованы для измерения цитотоксичности фотодинамической терапии на клетках остеосаркомы. Применение этого метода распространяется и на терапию остеосаркомы, поскольку он позволяет измерять эффективность фотодинамической терапии in vitro и напоминает метод, используемый в настоящее время у пациентов.

Чтобы сравнить поглощение M-T-H-P-C между клеточными линиями остеосаркомы, начните с осаждения 0,2 умножить на 10 до шестого Хосса и 143 В-клеток на лунку. В трех лунках в шести лунках дают клеткам прилипнуть в течение ночи до 80-90% плавности, а затем на следующий день инкубируют клетки с фиксированной концентрацией M-T-H-P-C в течение различных периодов времени в темноте, чтобы оценить зависящее от времени поглощение фотосенсибилизатора клетками. После инкубации аспирируйте среду и трижды промойте клетки PBS, затем отделите клетки 0,5 миллилитрами трипсина ЭДТА и подсчитайте их.

Затем раскрутите ячейки в течение пяти минут при 400-кратном G и комнатной температуре. Отсадите среду и повторно суспендируйте гранулу в PBS до конечной плотности от двух до 10 до пятых клеток на миллилитр. Пипеткой внесите 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку по 96 микролитров.

Хорошо наплавьте и измерьте флуоресценцию клеток в флуоресцентном спектрофотометре, установленном на 417 нм возбуждения и 652 нм излучения. Затем подготовьте стандартную кривую, поместив 100 микролитров от нуля до четырех миллиграммов на миллилитр концентраций M-T-H-P-C в трех экземплярах. В планшете с 96 лунками и измерьте флуоресценцию, как только что продемонстрировано, чтобы построить стандартную кривую для расчета единицы относительной флуоресценции каждой ячейки, содержащей лунку, из ранее измеренной пластины.

Для измерения фототоксичности фотосенсибилизатора сначала затравливают 3000 клеток в лунку в тройном размере на каждую концентрацию M-T-H-P-C в 96-луночном планшете, включая темные клетки контроля токсичности для каждой концентрации фотосенсибилизатора. Дайте клеткам прилипнуть в течение ночи до 50-60% плавности на следующий день. Инкубируйте клетки с различными концентрациями M-T-H-P-C в темноте в течение пяти часов после инкубации.

Отсадите среду и дважды промойте клетки PBS и добавьте свежую среду без M-T-H-P-C, специфичную для спектра поглощения M-T-H-P-C, надев соответствующие защитные очки. Установите диодный лазер с яркостью 652 нанометра на мощность 21,88 милливатт на квадратный сантиметр на высоте 13,5 сантиметров. Расстояние от ячеек для получения энергетической дозы составляет пять джоулей на квадратный сантиметр.

Затем осветите клетки, за исключением темновых клеток контроля токсичности, в течение 230 секунд после освещения. Держите клетки в темноте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем добавьте 10 микролитров wst, один реагент на 100 микролитров среды, через три часа после добавления wst один реагент измерьте поглощение отдельных лунок на 415 нанометров.

Наконец, подсчитайте количество выживших клеток в дополнение к одному анализу WST. Прямой подсчет клеток является вторым методом измерения токсичности клеток. Чтобы рассчитать процент жизнеспособных клеток, засейте два раза по 10-четвертую ячейки в лунку в 2 луночные планшеты по 24 лунки и дайте им прилипнуть на ночь.

На следующий день инкубируйте клетки в течение пяти часов в темноте с M-T-H-P-C и подсвечивайте их так, как только что было показано. Держите темные контрольные клетки в темноте через 24 часа, соберите надосадочную жидкость, промойте клетки один раз PBS и трипсиновыми глазками, окончательно раскрутите клетки и повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах свежей среды для подсчета. Результаты, проиллюстрированные на этом графике, показывают на верхней панели поглощение M-T-H-P-C в зависимости от времени с интенсивностью флуоресценции клеточной суспензии, представляющей внутриклеточные уровни M-T-H-P-C.

На нижней панели. Дозозависимое поглощение M-T-H-P-C можно оценить, измерив флуоресценцию M-T-H-P-C с помощью флуоресцентного спектрофотометра. Этот график иллюстрирует поглощение фиксированной концентрации M-T-H-P-C в зависимости от времени с интенсивностью флуоресценции клеточной суспензии, представляющей внутриклеточные уровни M-T-H-P-C.

На этом графике показано дозозависимое поглощение M-T-H-P-C в клетках Хааса и 143 В-клетках после пятичасовой инкубации. Поглощение в высокометастатической клеточной линии 143 B было значительно выше, чем в родительской клеточной линии с низким уровнем метастазирования. Показана дозозависимая темновая токсичность клеток остеосаркомы.

143 В-клетки были обработаны различными дозировками M-T-H-P-C и сравнивались с необработанными клетками, при этом наблюдалось дозозависимое снижение метаболической активности и количества клеток, измеренное с помощью одного из анализов. Снижение жизнеспособности клеток было выявлено при концентрации M-T-H-P-C, равной и превышающей 2,5 микрограмма на миллилитр. На нижнем графике показана дозозависимая токсичность M-T-H-P-C.

Клетки обрабатывали различными дозами M-T-H-P-C и последующим освещением со скоростью пять джоулей на квадратный сантиметр. Наблюдалось последующее снижение метаболической активности клеток, а также уменьшение их количества. Разработка этого метода проложила путь исследователям в области биологии рака, чтобы применять его к моделям остеосаркомы in vivo, а также для других доклинических исследований.