ЦГМФ-применимо Метод расширения для агрегатов человека нервных стволовых и предшественники клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или плода ткани головного мозга
15 июня 2014 г.
Этот протокол описан новый механический способ измельчения, что позволяет расширение сферических нервных стволовых и клеток-предшественников агрегатов без диссоциации к суспензии отдельных клеток. Поддержание клеток / клеток контакт позволяет быстро и стабильный рост на протяжении более 40 пассажей.
Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы эффективно проходить через нейросферы таким образом, чтобы контакт между клетками сохранялся на протяжении всей жизни культивируемых клеток. Этот метод создает условия для экспансии, необходимые для нейронных клеток-предшественников человека. Это достигается путем объединения до двух колб T 1 75 одинаковых клеток и переноса в коническую трубку, позволяющую в качестве второго шага переносить сферы в чашку Петри в качестве второго шага, конденсированные во взвешенные нейросферы в управляемую массу на чашке Петри, что позволяет лезвием разрезать H NPC на небольшие кластеры.
Затем пройденные или измельченные нейросферы ресуспендируются для того, чтобы извлечь клетки из чашки Петри и поместить их в новые колбы. Получены результаты, которые показывают, что метод рубления обеспечивает долгосрочную стратегию роста, основанную на кривых расширения, демонстрирующих долгосрочные логарифмические темпы роста по сравнению с клетками, прошедшими через стандартный ферментативный подход. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение как сферы.
Этапы конденсации трудно описать в письменном виде. Есть также несколько хитростей, которые помогут в этом процессе. Если избыток среды не будет полностью удален из чашки Петри, сферы будут просто перемещаться в среде, а не расщепляться на более мелкие кластеры.
Начните эту процедуру с рассмотрения цвета среды колбы с H-NPC. Просканируйте колбу под микроскопом, чтобы рассмотреть клетки. Если возможно, используйте радикал, чтобы изучить размер нескольких сфер.
Если многие сферы имеют диаметр 300 микрометров или более, продолжайте процесс измельчения и измельчайте ячейки каждые 7-10 дней. Затем поместите колбу обратно в инкубатор и установите измельчитель. Включите выключатель питания измельчителя.
В BSC установите толщину измельчения на 200 микрометров и усилие лезвия на 180 градусов или в положение «девять часов». Затем убедитесь, что ручка автоматической скорости повернута как можно дальше против часовой стрелки. Затем переместите ручку разблокировки стола как можно дальше вправо и убедитесь, что держатель пластины устойчив.
Поверните манипулятор ручного рычага по часовой стрелке, чтобы поднять рычаг до максимального уровня. После этого асептически перенесите стерильное обоюдоострое режущее лезвие на болт рычага измельчителя. С помощью щипцов поместите застежку на лезвие с помощью щипцов.
Изогнутая часть застежки должна находиться над верхним краем руки. Далее закрепите застежку на рычаге и закрепите гайку на болте. Со стерильной гайкой отверткой оставляем гайку на четверть оборота свободной.
В этой процедуре переложите предложенное количество поддерживающей среды в новую колбу. После этого асептически переносят клетки из инкубатора в БСК. Поставьте колбу на решетку для труб и дайте сферам осесть в колбе.
Один успокоился. Аспирируется до 12 миллилитров надосадочной жидкости. Серологической пипеткой объемом 10 миллилитров промойте все слабо прилипшие сферы с поверхности колбы.
Повторите при необходимости и позвольте сферам осесть между ренами. Далее переложите предложенный объем кондиционированной среды в новую колбу. Затем переложите все оставшиеся кондиционированные среды и сферы в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров.
Дайте сферам осесть и выбросьте использованную колбу. После этого медленно перенесите элементы из конической трубки объемом 15 миллилитров на 60-миллиметровую чашку Петри или диск-прокладку в минимально возможном объеме. Сохраните оставшуюся кондиционированную среду, так как она будет использоваться для промывки клеток из посуды после измельчения.
Постарайтесь свести к минимуму площадь поверхности, покрываемой средой и сферами на блюде. Затем начните конденсацию сферической ванны, переложив супернатин обратно в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Удалите как можно больше среды с верхней части пула медиа-ячеек с помощью микропипеттера с аэрозольным барьером.
До тех пор, пока нет возможности убрать медиа без сфер, то разложите бассейн. Используя боковую сторону наконечника пипетки для увеличения площади поверхности, слегка наклоните чашку Петри и используйте боковую сторону наконечника пипетки, чтобы осторожно сдвинуть все сферы на одну сторону бассейна. После того, как все ячейки будут перемещены, медленно наклоните чашку Петри в противоположном направлении, чтобы среда могла отделиться от сфер.
После этого переложите очищенный носитель обратно в коническую трубку объемом 15 миллилитров. С помощью кончика пипетки аккуратно сдвиньте все сферы обратно к центру чашки Петри. Так бассейн имеет диаметр от 0,5 до 2,4 сантиметра.
Важно, чтобы глубина сферического бассейна была небольшой. Если бассейн слишком глубокий, сферы будут отодвинуты в сторону во время рубки. Теперь переложите чашку Петри на держатель тарелки и закрепите ее под крючками держателя тарелок.
С помощью ручки разблокировки стола сдвиньте держатель пластины влево, чтобы лезвие освободилось от сфер и зафиксировалось на передаче. Затем опустите рычаг измельчителя, поворачивая ручку ручного манипулятора по часовой стрелке до тех пор, пока лезвие не приземлится на чашку Петри. Надавите на крепление рычага во время затягивания гайки.
Затем нажмите кнопку сброса. После этого зафиксируйте чашку Петри одной рукой, поворачивая ручку автоматического манипулятора по часовой стрелке в положение 90 градусов или 12 часов, и начните рубить, когда все сферы будут нарезаны. Поверните держатель тарелки на 90 градусов.
Затем ослабьте болт, опустите рычаг и снова затяните гайку. Повторите процедуру измельчения. После этого асептически переложите чашку Петри из держателя тарелки на рабочее место в BSC.
Переложите на измельченные сферы один миллилитр кондиционированной среды. Затем аккуратно суспензируйте и переложите нарезанные шарики в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Старайтесь избегать образования пузырей и повторяйте столько раз, сколько необходимо, чтобы собрать нарезанные сферы.
Измерьте объем кондиционированной среды и измельченных сфер. Добавьте соответствующее количество поддерживающей среды для достижения предложенного объема в таблице 2 столбец E. После этого Eloqua суспензию сферы в каждую новую колбу переносит только суспензию сферы в одну колбу за раз и повторно суспендирует сферы между переносами. Конечный объем в каждой колбе должен быть равен объему, предложенному в таблице 2 колонки F. Поместите измельченных h NPC в инкубатор.
На этом рисунке показано прогнозируемое количество клеток H-NPC, замороженных в пассаже 19, а затем размороженных и расширенных в виде адгезивного монослоя с использованием ферментативной диссоциации по сравнению с нейросферами, пропущенными методом рубки. Вот репрезентативные изображения предварительно нарезанных и пост-нарезанных сфер с 10-кратным увеличением. На этом изображении показаны NPC из прохода оттаивания 29 H, которые были покрыты в течение одного дня и окрашены для гнездования и сцеживания, в то время как на этом изображении показаны NPC из прохода 29 H, которые были покрыты в течение семи дней в отсутствие факторов роста и окрашены на GFAP и бета-три тубулина.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать технику автоматического измельчения для прохождения HBC, которая поддерживает межклеточный контакт на протяжении всей жизни клеток и культуры. Эта процедура может быть адаптирована к множеству типов клеток, таких как нейростволовые клетки, полученные из плюрипотентных клеток, или кардиосферы.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан новый метод механического измельчения, который позволяет расширять популяцию сферических агрегатов нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников без диссоциации до суспензии одиночных клеток. Сохранение межклеточных контактов обеспечивает быстрый и стабильный рост на протяжении более 40 пассажей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
Теоретическая часть
- Эффективный пассаж нейросфер имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток.
- Традиционные методы часто нарушают межклеточные контакты.
- В данном исследовании изучается метод механического измельчения для стимуляции роста.
- Стратегии долгосрочного культивирования необходимы для нейральных стволовых клеток человека.
Цель исследования
- Разработать метод, позволяющий сохранять межклеточные контакты в процессе пассирования.
- Сравнить скорость роста нейросфер, полученных методом механического измельчения, со скоростью роста при использовании стандартных ферментативных методов.
- Представить наглядную демонстрацию техники измельчения.
Используемые методы
- Объединение содержимого до двух флаконов T 1 75 с одними и теми же клетками.
- Перенос клеток в коническую пробирку для дальнейшей обработки.
- Разрезание агрегатов на мелкие кластеры с помощью лезвия.
- Ресуспендирование измельченных нейросфер для переноса в новые флаконы.
Основные результаты
- Метод измельчения способствует поддержанию долгосрочных логарифмических темпов роста.
- Результаты указывают на улучшение роста по сравнению с традиционными методами.
- Визуальные демонстрации подчеркивают эффективность данного метода.
- Измельченные нейросферы сохраняли более высокую жизнеспособность клеток с течением времени.
Выводы
- Метод механического дробления эффективен для экспансии нейральных клеток-предшественников.
- Сохранение межклеточных контактов имеет решающее значение для оптимального роста.
- Данная техника представляет собой перспективную альтернативу ферментативному пассированию.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод механического дробления позволяет масштабировать экспансию агрегатов нейральных стволовых клеток и клеток-предшественников человека при сохранении критически важных межклеточных контактов, что устраняет основное узкое место в производстве стволовых клеток как для исследовательских, так и для клинических целей. За счет исключения ферментативной диссоциации данный метод снижает риск дифференцировки и старения клеток, обеспечивая стабильное производство клинически значимых продуктов на основе нейральных клеток в условиях cGMP. Это делает данный метод ценным инструментом для снижения рисков при валидации нейральных мишеней на ранних этапах и позволяет создавать воспроизводимые доклинические модели.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Сохраняет физиологические межклеточные взаимодействия в культурах нейральных клеток-предшественников, что позволяет проводить более биологически релевантные исследования по взаимодействию с мишенями.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность долгосрочного экспансирования более 40 пассажей, гарантируя стабильное поступление клеток для итерационных кампаний по валидации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать гомогенные культуры сфероидов, подходящие для стандартизированных форматов анализов, требующих трехмерной клеточной архитектуры.
- Практическая ценность: обеспечивает высокий выход (>50 миллионов клеток на одну колбу T175) по сравнению с адгезивными культурами, что повышает пропускную способность скрининга и эффективность использования реагентов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает моделирование релевантных заболеваний за счет экспансии клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток или фетальных тканей, без фенотипического дрейфа.
- Практическая ценность: совместимость с производством по стандартам cGMP, что облегчает плавный переход от этапа разработки к клиническому масштабированию производства.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод измельчения вписывается в цикл от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая надежную экспансию нейральных прогениторных клеток для валидации мишеней, разработки анализов и снижения механистических рисков до этапа идентификации ведущих соединений.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез посредством длительного культивирования физиологически релевантных нейронных агрегатов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые результаты с большим количеством клеток, что необходимо для стандартизации анализа и проведения кампаний по скринингу соединений.
- Аналитика: позволяет количественно оценивать кинетику экспансии и показатели жизнеспособности для принятия решений о продолжении или прекращении исследований.
- Трансляционные исследования: сохраняет клеточную идентичность на всех этапах — от открытия до доклинической валидации, снижая биологическую вариабельность.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую автоматизированную платформу для пассирования, применимую для различных источников нейральных стволовых клеток.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Прогностическая достоверность за счет сохранения естественных межклеточных контактов и снижения количества артефактов, вызванных культивированием.
- Операционная ценность: Стандартизированный механический пассиж сводит к минимуму влияние человеческого фактора и обеспечивает масштабируемость и воспроизводимость процессов.
- Стратегическая ценность: Снижение биологических рисков в программах по нейральным мишеням за счет обеспечения стабильного качества клеток от пассажа к пассажу.
- Влияние на портфель: Позволяет принимать обоснованные решения о продвижении с учетом рисков благодаря надежному снабжению клетками, соответствующими стандартам cGMP, для доклинических и клинических исследований.
Особенности реализации
- Требуется обучение методам асептики и правилам работы с механическим измельчителем.
- Необходим доступ к стерильным лезвиям, коническим пробиркам, чашкам Петри и инкубаторам.
- Требуется стандартизация этапов конденсации и ресуспендирования для обеспечения однородного распределения сфер по размеру.
- Адаптация метода для различных модельных систем может потребовать оптимизации толщины измельчения и силы нажатия лезвия.
- Практические ограничения включают необходимость ручного удаления среды в процессе конденсации, что может снизить пропускную способность при отсутствии оптимизации.
