ChroP подход сочетает в себе чип и масс-спектрометрии для Рассеките Локус-специфические протеомные Пейзажи хроматина

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы охарактеризовать протеомный состав функционально различных хроматиновых доменов, чтобы понять, как различные элементы взаимодействуют друг с другом для определения транскрипционного состояния. Восемь. Это достигается путем предварительного получения ядер из культивируемых клеток и расщепления хроматина во фрагменты оптимальной длины с помощью ферментативных или механических средств. Второй шаг заключается в очистке отдельного функционального домена от объемного хроматина путем иммунопреципитации с использованием антител-приманок либо против посттрансляционной модификации гистона, либо против белка, который, как известно, специфически маркирует интересующую область.

Затем иммуноочищенные белки хроматина разделяют с помощью страницы SDS и ингеля расщепляют перед масс-спектрометрией. Следующим этапом является масс-спектрометрический анализ жидкостной хроматографии на приборе с высоким разрешением. В конечном счете, исходные данные масс-спектрометрии анализируются специальным программным обеспечением, за которым следует ручная проверка спектров для идентификации и количественного определения модификаций гистонов и белков, обогащенных ценом, соответственно, либо на основе расчета относительной концентрации в иммуноосадатированном материале по отношению к входным данным, либо на основе соотношения SLAC и экспериментов по конкуренции с использованием растворимого пептида в качестве конкурента приманки. Мы можем получить представление о взаимодействии между паттерном модификации гистограммы и дисперсией и добраться до конкретных областей хроматина и рекрутируемого ими ядерного интерактива, которые действуют согласованным образом.

Для определения специфического хроматинового ландшафта с регуляторным влиянием на экспрессию генов, основным преимуществом культуры является существующий метод, основанный на скрининге in vitro на предмет растворимого взаимодействия или модификации гистограммы, такой как вытягивание задницы вниз. Использование либо гистонового пептида, либо восстановленных хроматиновых матриц дает возможность исследовать локус-специфичный состав хроматина в более нативных, менее искусственных условиях. Применение сельскохозяйственных культур также может быть расширено на другие модельные системы или в нестационарном исследовании.

Например, мы можем использовать культуру в клеточной линии, которая реагирует на определенные возмущения, вызывая глобальную транскрипционную реакцию. Демонстрировать эту процедуру будет Моника Соди. Постдок в моей лаборатории Ядра для процедуры N-чипа готовятся из немаркированных.

Клетки A S3 используют от одного до двух раз от 10 до восьмой клетки за эксперимент. Чтобы собрать клетки, сделайте четыре аликвоты в пять раз по 10 на семь клеток в 50-миллилитровых пробирках и центрифугируйте при 340 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Промыть камеры ледяным ПБС отбросить надосадочную жидкость и резонатор.

Суспендируйте каждую клеточную гранулу в восьми миллилитровах, лизисите, буферизуйте и переложите в 15-миллилитровые пробирки. Выдерживайте в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия на вращающемся колесе. Затем осторожно налейте каждый клеточный лизат на подушку из сахарозы и центрифугируйте в поворотном роторе при температуре 3,270 G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить ядра от цитоплазмы.

Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте ядерные гранулы ню в льду. Холодный ПБС при второй стирке. Соберите ядра в одну 50-миллилитровую пробирку, выбросив надосадочную жидкость из второй промывки.

Ресуспендируйте ядерную гранулу в одном миллилитре буфера для разложения. Разделите каждую пробу на две аликвоты по 500 микролитров и держите на льду. Добавьте к каждой аликвоте пять микролитров МНК, что соответствует конечной концентрации 0,005 единиц фермента на микролитр ядер.

Аккуратно перемешайте и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. Добавьте один миллимоляр ЭДТА, чтобы остановить реакцию и удержать на льду. Гранулируйте переваренные ядра методом центрифугирования при температуре 7,800 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Переложите надосадочную жидкость в две пробирки и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Это S one фракция, которая содержит первую растворимую фракцию хроматина, содержащую мононуклеозоны, тщательно ресуспендирует гранулы в одном миллилитре диализа, буферизирует и диализирует на ночь при четырех градусах Цельсия в трех литрах диализного буфера с постоянным легким перемешиванием на следующий день. Соберите диализованный материал и центрифугируйте при 7 800 перегрузках в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Переложите супернатин в новую эйноровую трубку. Это S-2 фракция, которая окрашивается в нуклеосомы tta в зависимости от степени переваривания Ma a. Хранить при температуре четыре градуса Цельсия перед иммунопреципитацией.

Проверьте качество и недостаточность расщепления MN a с помощью электрофореза в геле aros и визуального осмотра лестницы нуклеосом, как показано в этом примере, фракция S 1 сильно обогащена мононуклеозонами, в то время как фракция S 2 содержит в основном нуклеосом для иммунопреципитации хроматина. Сначала добавьте один объем буфера разбавления чипа к одному обрамлению S. Затем добавьте антитело против гистонов посттрансляционной модификации или интересующего вас белка и инкубируйте в течение ночи на вращающемся колесе при температуре 4 градуса Цельсия на следующий день.

Выделите хроматин с помощью магнитных шариков, сопряженных с белком G. Добавьте 100 микролитров заблокированных шариков к образцу хроматина S one и инкубируйте на вращающемся колесе при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех часов. Через три часа.

Центрифугируйте при 340 перегрузках в течение одной минуты. Поместите трубки эйнора в магнитную решетку, чтобы гранулировать шарики. Сохраните надосадочную жидкость, которая представляет собой сквозной поток, содержащий несвязанную нуклеосому.

Добавьте в шарики буфер для промывки и выдерживайте в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия на вращающемся колесе перед центрифугированием. Таким образом, промойте бусины в общей сложности четыре раза с возрастающей концентрацией соли. Две промывки при 75 миллимолярах хлорида натрия, затем одна промывка при 125 миллимолярах и другая при 175 миллимолярах хлорида натрия для элюирования.

Амино осаждал хроматин. Инкубируйте шарики в 30 микролитрах буфера LDS Sample с добавлением 50 миллимолярных дихи. Три этола в течение пяти минут при 70 градусах Цельсия.

Затем упомянутые белки отделяются с помощью страницы SDS, чтобы начать эту процедуру, сшивая клетки формальдегидом. Добавьте 0,75% формальдегида в клетки, меченные SLAC. Быстро перемешайте и выдержите 10 минут при комнатной температуре.

Наведите формальдегид на место, добавив 125 миллимолярного глицина и инкубируя в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем разделите ячейки на две-четыре аликвоты примерно в пять раз по 10 до семи ячеек в аликвоте. Промойте ячейки трижды ледяным PBS после последней стирки.

Выбросьте надосадочную жидкость и храните гранулы, ресуспендируя каждую клеточную гранулу в 10 миллилитрах буфера для лизиса. Инкубировать в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия с вращающейся центрифугой при 430 перегрузках в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте ядерные гранулы.

После промывки ядерных гранул промывочным буфером Resus, суспензируйте каждую ядерную гранулу в трех миллилитрах инкубационного буфера чипа и держите на льду для фрагментации хроматина ультразвуком в охлажденном биоразрыве при мощности 200 Вт. Удалите 2% звукового хроматина и обратите вспять поперечное сшивание путем инкубации при 65 градусах Цельсия в течение как минимум одного часа. В чипе инкубационный буфер.

Это исходный материал. Впоследствии ДНК экстрагируют с помощью набора для очистки ПЦР, а фрагментацию хроматина оценивают с помощью электрофереза в геле aros для иммуноосаждения сшитого хроматина. Добавьте выбранное антитело к легкому и тяжелому меченому ультразвуком хроматину.

В световой канал добавьте избыточную кратность растворимого пептида в дополнение к аликвоте антител как легких, так и тяжелых образцов в каждую из трех пробирок микроцентрифуги и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия на вращающемся колесе на следующий день, добавьте 100 микролитров магнитных шариков, связанных с блокированным белком G, к каждому образцу хроматина и инкубируйте на вращающемся колесе в течение трех часов при четырех градусах Цельсия. Центрифугируйте при 340 умноженных на G в течение одной минуты. Поместите трубки эйнора в магнитную решетку, чтобы гранулировать шарики.

Надосадочная жидкость – это сквозной поток, содержащий несвязанные нуклеосомы, который сохраняется для последующего контроля. Промыть бусины четыре раза в промывочном буфере с возрастающей концентрацией солей. Две промывки при 150 миллимолярном хлориде натрия с последующим двумя промывками при 300 миллимолярном хлориде натрия.

Инкубируйте бусины в течение 25 минут при температуре 95 градусов Цельсия и 30 микролитрах SDS страницы. Загрузка буфера образца для элюирования и сшивания иммунопреципитированных белков. Наконец, объедините EITs и разделите белки по странице SDS перед масс-спектрометрией.

Гистоны, обогащенные NIP, расщепляются для начала этой процедуры. Гелевые срезы, соответствующие основным полосам гистонов, из коллоидного кумаси, окрашенного от 4 до 12% акриламидного градиентного геля BIS, CITRIS, вырезаются, а затем окрашиваются 50% ацетилнитрилом и деионизированной дистиллированной водой, чередующейся со 100% ацетонитрилом, чтобы уменьшить гель, когда кусочки геля полностью окрашиваются. Высушите их в вакуумной центрифуге.

Добавьте к кусочкам геля от одного до девяти объемов на объем в одном моляре бикарбоната аммония и три микролитра ацетата натрия в качестве катализатора. Выдерживать в течение трех часов при температуре 37 градусов Цельсия при сильном встряхивании. Сожмите кусочки геля в 100% ацетилнитриле, а затем обезвожьте их в течение примерно пяти минут в вакуумной центрифуге, затем увлажните кусочки геля ледяным холодом.

100 нанограмм на микролитр раствора триина в 50 миллимолярном бикарбонате аммония в течение ночи при 37 градусах Цельсия. Комбинация химической модификации лизинов с помощью дейтерированного уксусного ангидрида и расщепления трипсина генерирует RC, как в геле, схема расщепления гистона собирает растворимые расщепленные пептиды в новую эйнорскую трубку и сушит пептиды в течение примерно одного часа. Ресуспендируйте лиофилизированные пептиды в 0,5% уксусной кислоте, 0,1% Tri Fluor уксусная кислота обессолите и концентрируйте пептиды на углеродном сэндвиче с обратной фазой C 18 и ионообменной хроматографии на микроколонках ручной работы.

Загрузите 50% пептидов на кончик ступени C 18 из углерода и 50% в пептиды ступени SCX Пептиды Elut из зондов SCX с использованием 5% гидроксида аммония, 30% метанола и из углеродных наконечников C 18 с использованием 80% ацетонитрила, 0,5% уксусной кислоты. Наконец, лиофилизировать, ускользающие пептиды и суспендировать их в 0,1%-ной муравьиной кислоте при нативном хроматиновом иммунопреципитации и культурном подходе. Хроматин расщепляется с помощью МНК в качестве первого шага по очистке отдельного функционального домена от объемного хроматина.

На панели слева показан небольшой тест МНК, в котором ДНК растворяется на геле с 1% аросом после расщепления хроматина с МНК в разные промежутки времени. Справа показано крупномасштабное разложение МНК. ДНК растворяется на геле 1%aros после 60 минут расщепления хроматина МНК и после отделения S-одной фракции, содержащей мононуклеозоны, и от S-двух фракций, содержащих полинуклеосомы.

Расщепленный хроматин и обогащенный мононуклеосомами инкубируется с антителом, которое распознает специфическую посттрансляционную модификацию гисона. Например, триметилирование лизина nine на гистоне H three K nine ME three, маркере молчащего хроматина. Затем иммуноочищенные белки, а также входящий хроматин разделяют с помощью страницы SDS, и окрашивание коллоидной кумаси показывает ядро гистонов H 3, H 4, H два A и H два B вокруг и ниже зоны 17 килодальтон с H три и H два B co. Сравнение между количеством тримм, метилированного глицина, девять на H три, присутствующих в потоке через и вход, показывает, что около 50% Область интереса иммуноочищена, что исключает риск смещения из-за обогащения незначительной субпопуляцией хроматина.

Эта гистограмма представляет собой среднее значение плюс минус SEM из трех независимых экспериментов для каждой модификации, затем МС используется для характеристики посттрансляционных модификаций, ассоциированных в обогащенных нуклеосомах. Все посттрансляционные модификации гистонов верифицируются путем ручного контроля соответствующих спектров ms ms в этом репрезентативном спектре Ms m Ms с использованием фрагментации CID. Ряды ионов B и Y позволяют определить последовательность пептида от H 3 9 до 17, а локализация триметилирования на остатке лизина девяти без меток достигается путем предварительного построения хроматограммы экстрагированного иона, или XIC для каждого из них, соответствующего каждому модифицированному пептиду на основе значения массового заряда, и вычисления площади под кривой или UC для каждого пика.

Далее, относительная распространенность различных степеней метилирования лизина 9 в пептиде от H 3 9 до 17 оценивается путем деления A UC каждого модифицированного пептида на сумму площадей, соответствующих всем наблюдаемым немодифицированным и модифицированным формам этого пептида. В-третьих, относительное обогащение каждой модификации в сколотом материале выражается в виде логарифмического соотношения двух между относительным содержанием каждого метилирования в сколотом пептиде к входному материалу. Анализ пептида H-3-9-17 показывает обогащение D и TRIMM метилированным лизином 9 с соответствующим истощением немодифицированных и монометильных форм.

С этими результатами в качестве положительного контроля специфичности антител ассоциация cos или истощение всех других модификаций может быть оценена как на внутримолекулярном уровне на том же H-3, так и на межмолекулярном уровне на других обогащенных коэнами гистонах в пределах той же нуклеосомы. Эта репрезентативная тепловая карта обобщает обогащение всех cos-ассоциированных H. ptm, идентифицированных на гистоне H 3, H 4 и H 2 A. Каждая строка соответствует отдельной модификации, а ND указывает на необнаруженные модификации для скрининга всех белков. Коассоциация в чипе гетерохроматина сшитого хроматина, фрагментированного ультразвуком, используется в сочетании с мечением стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре или лаке.

Во-первых, эффективность мечения оценивается путем расчета включения в белки тяжелого лизина и тяжелого аргинина. Для точного количественного определения требуется включение белка, превышающее 95% для обеих тяжелых аминокислот, как это наблюдается здесь, медиана распределения плотности лизина и пептида аргинина равна 0,974 и 0,964 соответственно. Во-вторых, необходимо оптимизировать соотношение растворимого пептида и антител.

На этом рисунке показан увеличенный масс-спектр при соответствующем значении массового заряда двух плюс заряд тримм-метилированного лизина 9 K 9 ME три в пептиде H three nine to 17, как для легких, так и для тяжелых форм на входе и сколотом octr. Во время входного сигнала интенсивность тяжелого и легкого пептида близка к единице в прямом чипе SLAC. Интенсивность легкого пептида значительно ниже, чем у тяжелого аналога, что свидетельствует об эффективной конкуренции.

Здесь показан репрезентативный результат страницы SDS с легким и тяжелым H, меченным хроматином и чипом осажденного материала coamino. Дорожка, соответствующая измельченному материалу, была разрезана на 10 срезов, в то время как анализировались только два среза входного материала. Для анализа инкорпорированных тестов эксперименты с конкуренцией slac обычно проводятся в дубликатах, в так называемых прямом и обратном форматах, где конкуренция с избыточным растворимым пептидом переключается с тяжелых образцов H на легкие образцы L-хроматина.

Этот репрезентативный полный спектр показывает пару SLAC, соответствующую пептидам из белков HP One и макро 2 A, соотношение тяжелого и легкого белка больше единицы. В прямом эксперименте, отраженном соотношением меньше единицы в обратной реплике, продемонстрировать специфическое обогащение этих белков в белках гетерохроматина, интенсивность которых в тяжелой и легкой формах одинакова как в прямом, так и в обратном экспериментах, дает постоянное отношение, близкое к единице, и классифицируется как фоновое. Пересечение прямых и обратных экспериментов с X-чипом приводит к идентификации 635 белков, присутствующих в обоих экспериментах и количественно оцененных по крайней мере с помощью двух подсчетов соотношения.

График log two их соотношения тяжелого и легкого представляет собой так называемую гетерохромосому. Красные пунктирные линии на этой диаграмме рассеивания представляют верхние 40% и 30% соотношения белков. Как указано, подлинные девяти интеракторов тримм, метилированных лизином, однозначно идентифицируются как белки, присутствующие в верхних 40% распределений белкового соотношения.

Здесь черным, синим и оранжевым цветом показаны распределения соотношения белков в экспериментах с входными прямыми и обратными культурами X соответственно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как получить хроматин для Е и конечного урожая для обработки монопреципитатированных белков перед масс-спектрометрическим анализом. Как идентифицировать и количественно оценить модификацию гистона в масс-спектрах и как определить специфический интеракт в их белковых соотношениях.